Сравнение патоморфологических свойств нерезорбируемого и частично резорбируемых имплантов для реконструктивной хирургии пролапса тазовых органов и стрессового недержания мочи: экспериментальное исследование

Введение

На современном этапе развития реконструктивной хирургии тазового дна у женщин всё ещё очевиден тот факт, что в ряде случаев применение трансвагинальных сетчатых имплантов является необходимостью. Так, имплантация субуретрального синтетического слинга является «золотым стандартом» коррекции стрессового недержания мочи даже в тех странах, где существует частичный или полный запрет на использование сетчатых имплантов для коррекции пролапса тазовых органов [1].

Однако известно, что применение трансвагинальных сетчатых имплантов не лишено специфических осложнений, значимо ухудшающих качество жизни пациенток [2]. Причиной осложнений может являться как сам имплант, так и нарушение техники установки [3][4]. Вместе с тем важно отметить, что в настоящее время на рынке не осталось тяжёлых, микропористых сетчатых имплантов, применение которых значимо повышало риск возникновения типичных имплант-ассоциированных осложнений: эрозий и хронической тазовой боли. Именно это и привело к введению ограничений использования трансвагинальных сетчатых имплантов в урогинекологии. Однако и современные лёгкие эластичные макропористые импланты не лишены недостатков ввиду применения в их производстве перманентных материалов. Самым распространённым материалом для производства сетчатых имплантов является полипропилен [5]. Было доказано, что количество используемого перманентного материала напрямую коррелирует с риском возникновения имплант-ассоциированных осложнений [4][6][7].

Таким образом, необходима разработка нового поколения имплантов, сохраняющих преимущества перманентного сетчатого импланта, но с минимизацией рисков имплант-ассоциированных осложнений. Ранее нами была разработана частично резорбируемая система доставки лигатур для аксиальной фиксации структур тазового дна, произведён технический анализ, сравнение биомеханических и патоморфологических свойств после имплантации в эксперименте на живом организме [8][9].

Существует малое количество исследований реакции живого организма на подобный тип синтетического импланта, несмотря на то, что в производстве вышеописанной системы доставки лигатур применяются широко используемые материалы — полипропилен, полиглекапрон, полидиоксанон. Данный факт обусловливает необходимость проведения сравнительного гистологического исследования реакции живого организма на имплантацию частично резорбируемой системы доставки лигатур.

Цель исследования. Сравнение гистологических изменений в мягких тканях передней брюшной стенки кролика в зоне имплантации нового поколения частично резорбируемого импланта и нерассасывающегося полипропиленового сетчатого импланта в эксперименте на кроликах.

Материалы и методы

Исследование было выполнено в соответствии с этическими нормами обращения с животными, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для исследовательских и иных научных целей (CETS 123), Федерацией европейских ассоциаций по науке о лабораторных животных (FELASA), Международным советом по науке о лабораторных животных (ICLAS). Исследование было проведено на 39 самцах кроликов породы шиншилла со средним весом 3200 ± 250 г. Лабораторные животные были получены и размещены в виварии Северо-Западного государственного медицинского университета им. И.И. Мечникова, затем рандомизированы на 3 группы в соответствии с имплантируемым материалом: 15 кроликам (группа 1) имплантировали частично резорбируемую систему доставки лигатур Аксилен © (Линтекс, Санкт-Петербург, РФ) состоящую на 98% из полидиоксанона и на 2% из полипропилена, 15 кроликам (группа 2) имплантировали частично резорбируемую систему доставки лигатур Аксилен Рапид © (Линтекс, Санкт-Петербург, РФ), состоящую на 98% из полиглекапрона и на 2% из полипропилена, 9 кроликам (группа 3) имплантировали нерассасывающийся полипропиленовый сетчатый имплант Урослинг 1 © (Линтекс, Санкт-Петербург, РФ).

Размер имплантов был стандартизован и составил 10 × 1,5 см для всех эндопротезов. После имплантации кролики всех 3 групп случайным образом были разделены на 3 равные по количеству подгруппы в соответствии со сроком выведения из эксперимента: 14, 60 и 180 дней. После выведения животных из эксперимента было произведено эксплантирование имплантов с окружающими фиброзно-мышечными тканями. Препараты были помещены в транспортные контейнеры с 10%-ным раствором формалина и доставлены в лабораторию ООО «МЛЦ» на исследование. Флаконы были подписаны с указанием № животного в группе (от 1 до 5), наименования имплантированного материала (Урослинг, Аксилен, Аксилен Рапид) и срока выведения из эксперимента. Материал каждого животного был вырезан, помещён в гистологические кассеты, кассеты подписывались с указанием наименования группы, срока выведения, номера животного в группе (рис. 1). Участки импланта были взяты тотально в поперечном сечении. Анализ проводился по совокупности выявленных изменений на всех уровнях протяжённости импланта в исследуемом фрагменте.

Гистологический анализ. Материал в кассетах прошел этапы пробоподготовки. Обезвоживание и пропитывание парафином проводили по стандартизированной методике в автоматическом гистологическом процессоре ExcelsiorТМ AS («Thermo Fisher Scientific, Inc.», Waltham, MA, USA) в готовом растворе IsoPREP («Биовитрум», Санкт-Петербург, РФ) и парафиновой среде HISTOMIX («Биовитрум», Санкт-Петербург, РФ). С использованием ротационного микротома НМ 325 («Thermo Fisher Scientific, Inc.», Waltham, MA, USA) изготовляли срезы толщиной 2 – 3 мкм, которые в дальнейшем депарафинировали, дегидратировали, окрашивали гистологическими методами по общепринятой стандартизированной методике гематоксилином-эозином (Г-Э) в соответствии с рекомендациями производителя («Биовитрум», Санкт-Петербург, РФ), PAS-методом, толуидиновым синим, трихром по Masson.

Микроскопическое исследование проводилось на микроскопе AXIO LAB.A1 («Carl Zeiss AG», Oberkochen, Germany) при ув. × 40, × 100, × 200, × 400, × 1000. Результаты анализа были занесены в Excel-таблицы в виде абсолютных значений.

Статистический анализ. Количественные признаки описаны как среднее ± стандартное отклонение и медиана и интерквартильный размах. Для анализа количественных признаков использовался метод Kruskall-Wallis. Категориальные признаки описаны как абсолютные значения и проценты (%). При анализе категориальных переменных использовался критерий Fisher. Двусторонний уровень значимости установлен как 0,05. Все вычисления производили с использованием языка программирования R версии 4.3.3 («The R Foundation for Statistical Computing», Vienna, Austria).

Результаты

Основные результаты патоморфологического исследования представлены в таблице 1. Примеры гистологической картины на различных сроках имплантации показаны в таблице 2.

Эозинофилы. В результате исследования было выявлено, что наибольшая инфильтрированность эозинофилами на всех сроках отмечалась в группе 3 с максимальным проявлением на сроке 60 дней: данные соотносились с выраженностью вторичных экссудативно-воспалительных процессов и свидетельствовали о высокой вторичной лейкоцитарной активности в тканях, окружающих имплант на протяжении срока не менее 60 дней.

При этом воспалительный процесс стихал к 180-му дню. Наименьшую лейкоцитарную инфильтрацию регистрировали в группе 2 с максимумом своего проявления на 14-й день и затиханием активности к 180-му дню. Таким образом, динамика этого показателя в группах различного срока с итоговым уменьшением к 180-му дню свидетельствовала о том, что инфильтрация эозинофилами отражала некие закономерные воспалительные процессы, индуцированные имплантируемым материалом на сроках 14 и 60 дней, и проявляла себя наиболее мягко в группе 1 и 2 по сравнению с группой 3. Раздражающее (механическое) действие полипропиленового импланта Урослинг наблюдали на протяжении не менее 2 месяцев, импланта Аксилен — не менее 14 дней. Имплант Урослинг вызывал наиболее выраженную гранулоцитарную инфильтрацию на сроках 14 и 60 дней с максимумом на 60-й день. Имплант Аксилен вызывал менее выраженную гранулоцитарную инфильтрацию и только на ранних сроках (14 дней).

В свою очередь, имплант Аксилен Рапид не вызывал гранулоцитарной инфильтрации окружающих тканей на всех сроках эксперимента, что свидетельствовало о более мягком (менее травматичном) взаимодействии нитей импланта с окружающими тканями на всех сроках имплантации.

Лимфоциты. Как известно, лимфоциты отражают иммунологические механизмы реагирования на присутствие имплантированного материала и вторичные воспалительные реакции. Обращало на себя внимание, наряду с выявленными вторичными экссудативными воспалительными процессами, что в группе 3 к 60-му дню имеет место максимальная выраженность инфильтрированности лимфоцитами на фоне общей высокой воспалительной инфильтрации, полностью исчезающая к 180-му дню по сравнению с группами 1 и 2, что говорит об истощении иммунологических стимулов и развитии инертности к имплантируемому материалу к этому сроку. При этом в группе 2 отмечалась наиболее выраженная инфильтрация лимфоцитами на всех сроках при отсутствии вторичных воспалительных реакций — это свидетельствовало о потенцировании более выраженных иммунологических стимулов материалом импланта на протяжении всех сроков с 14-го по 180-й день. Инфильтрация лимфоцитами в группах 1 и 3 на ранних сроках была обусловлена не только материалом импланта, но и собственно вторичным воспалительным процессом, поэтому можно предположить, что истинная реакция на материал должна была быть значительно менее выраженной. Оценка лимфоцитарной инфильтрации позволяет предположить, что имплант Аксилен Рапид потенцировал более выраженный и более стойкий иммунологический ответ на протяжении всего срока наблюдения по сравнению с имплантами Аксилен и Урослинг.

Макрофаги. Макрофаги отражают общую реакцию организма на присутствие инородного материала. В группе 3 отмечали постепенное нарастание количества макрофагов к сроку 180 дней, что говорило о замедленной, вялотекущей реакции организма на нахождение имплантированного материала, а с учётом того, что рассасывания нитей сетчатого импланта не происходило, такая концентрация макрофагов свидетельствовала о безуспешной попытке организма к резорбции. В группе 1 нарастание происходило к 60-му дню с более выраженной макрофагальной реакцией по сравнению с группой 3, и интенсивность инфильтрации сохранялась вплоть до 180-го дня, что свидетельствовало о продолжающейся фазе резорбции. Также отмечалась более ранняя активация макрофагального пула в группе 2 с более выраженной инфильтрацией макрофагами по сравнению с другими группами на 14-й день опыта, максимальной концентрацией к 60-му дню (активная резорбция части импланта) и последующим снижением количества макрофагов к 180-му дню по сравнению с группой 1. Сохранение уровня инфильтрированности макрофагами свидетельствовало о потенцировании организма к отграничению оставшегося инородного материала.

Гигантские многоядерные клетки (ГМК). Формирование и наличие многоядерных гигантских клеток типа инородных тел свидетельствовало о текущей резорбции инородного материала — чем их больше, тем выраженнее и целенаправленнее резорбция. В группе 3 максимальное количество клеток формировалось в первые недели имплантации, на сроках 60 и 180 дней клетки были единичными, что свидетельствовало о безуспешности резорбции данного вида материала и его инертности, стимулов для формирования ГМК недостаточно. В группе 1 отмечалось более выраженное формирование ГМК с максимальным количеством к 60-му дню, что соответствовало активной резорбции части нитей импланта. К 180-му дню количество ГМК снижалось, но оставалось в достаточном количестве, что свидетельствовало о продолжающемся потенциировании их формирования для осуществления резорбции элементов импланта. В группе 2 отмечалось наибольшее формирование ГМК среди всех групп, с максимальным значением на сроке 60 дней, что обусловливало активное рассасывание деградируемого материала в этот интервал времени. К 180-му дню количество клеток снижалось, но оставалось на достаточном уровне — потенциирование (стимул) к их формированию и активности продолжало действовать.

Таким образом, пул макрофагальной и гигантоклеточной популяции не был связан с вторичным воспалительным экссудативным процессом, он отражал ожидаемые закономерности реакции организма на нахождение имплантированного материала и выявлял следующие особенности в группах: нерассасывающийся имплант Урослинг потенцировал активность макрофагов с постепенным увеличением их пула к сроку 180 дней, при этом ГМК появлялись в первые недели имплантации в небольшом количестве и практически отсутствовали на сроках 60 и 180 дней, что говорило о его инертности. При этом элементы импланта оставались в неизменённом качестве на протяжении всего срока эксперимента, что вызывало значимую фибропластическую реакцию в окружающих тканях. Имплант Аксилен частично резорбировался к 60-му дню, что отражалось в максимальном количестве пула макрофагов и ГМК, в дальнейшем процессы рассасывания приостанавливались, количество ГМК значительно сокращалось, а количество макрофагов оставалось высоким, что обусловливало фибропластическую реакцию (формирование капсулы). Имплант Аксилен Рапид показывал на ранних сроках (14 дней) максимальное количество привлечённых макрофагов (то есть материал вызывал активацию макрофагов более раннюю и более выраженную по сравнению с Аксиленом), пул которых нарастает к 60-му дню, на этом же сроке отмечалось наибольшее количество ГМК (разлагаемый материал активно резорбировался на сроке 60 дней), биохимические особенности биоразлагаемого компонента потенцировали образование значительно большего количества ГМК по сравнению с группами 1 и 3. К 180-му дню отмечалось снижение пула макрофагов, концентрирующихся исключительно на остаточных неразлагаемых элементах импланта. Можно утверждать, что реакция на остаточные элементы мягче и менее выражена относительно неразлагаемых элементов Аксилена и Урослинга.

Эндотелий. Эндотелий (клетки эндотелиоциты зрелые и незрелые) в структуре инфильтрата отражают процессы неоваскуляризации, рост грануляционной ткани, её зрелость, редукцию, формирование временного либо стойкого кровеносного русла, что оказывает влияние и отражает процессы воспаления, ремодуляции, формирования новых тканевых структур. Формирование сосудистых почек происходит уже на 2 – 4-й день повреждения тканей, молодые капилляры содержат реактивные набухшие эндотелиальные клетки, поэтому их обнаружение свидетельствует о продолжающемся ангиогенезе и наличии каких-либо стимулов. Вывод общий по ангиогенезу в ложе импланта: в группе 3 максимальное количество вновь образованных сосудов регистрировалось на 60-й день. К 180-му дню отмечалась полная редукция сосудистого русла с сохранением остаточных капилляров. В группе 1 отмечался умеренный ангиогенез без всплесков активности с незначительным увеличением общей площади капиллярного русла к 60-му и 180-му дню. Учитывая факт того, что имплант содержал нерезорбируемую часть, а разлагаемые элементы даже на сроке 180 дней ещё претерпевали деградацию, текущий ангиогенез свидетельствовал о незавершенных процессах резорбции, фиброплазии и т.д. В группе 2 обращал на себя внимание значительно выраженный с первых недель имплантации ангиогенез по сравнению с другими группами с преобладанием вновь образованных сосудов и пролонгированным неоангиогенезом даже на сроке 180 дней. Эти данные косвенно свидетельствовали о потенциирующем неоваскуляризацию действии недеградируемого материала с длительным поддержанием стимуляции к васкуляризации зоны импланта на фоне текущей фиброплазии.

Фибробласты. Фибробласты отражают процессы активного фиброгенеза — формирование свежих, вновь образованных соединительнотканных структур. В группе 3 потенциирование фиброгенеза происходило постепенно, максимум достигался на 60-й день и совпадал с экссудативным воспалением. Процесс фиброгенеза завершался к 180-му дню. С учётом того, что элементы импланта не рассасывались, можно было предположить, что в скором времени произошло бы оголение его структур — возможны осложнения травматического характера. В группе 1 потенциирование фиброгенеза было выражено уже на 14-й день эксперимента, отмечалось значительное снижение его активности к 60-му дню. В группе 2 потенцирование фиброгенеза было наиболее выражено среди всех групп на сроках 14 и 60 дней и не было связано с экссудативными процессами. Отмечалось планомерное снижение количества фибробластов к 180-му дню.

Фиброциты. Фиброциты отражают процессы фиброгенеза зрелого этапа формирования соединительной ткани, как правило, сочетаются с коллагенообразованием фиброзных структур типа капсул, рубцов. В группе 3 выявлялось большое количество зрелых клеток фиброцитов на сроках 14 и 60 дней, что было связано параллельно с выраженными экссудативными воспалительными процессами вторичного плана. К 180-му дню количество клеток снижалось, преобладали зрелые структуры соединительнотканных волокон. В группе 1 определялись фиброциты на всем протяжении опыта в небольшом количестве. В группе 2 отмечалось чёткое соответствие зрелых и незрелых форм фиброцитов и фибробластов на сроках 14, 60 и 180 дней с планомерным увеличением количества фиброцитов на фоне планомерного снижения количества фибробластов. По сравнению с другими группами процесс фиброгенеза выглядел более урегулированным. Необходимо было иметь в виду наличие вторичных экссудативных воспалительных изменений в группах 1 и 3, которые, по всей видимости, вмешивались в процессы фиброгенеза и оказывали дисрегулирующую роль.

Обращали на себя внимание координация и согласованность ангиогенеза и фиброгенеза в группе 2 в течение сроков эксперимента. Процессы протекали планомерно, возможно, из-за отсутствия вторичных воспалительных изменений и сохраняли текущую активность к 180-му дню.

Общая тканевая реакция. Если суммировать результаты гистологического исследования, обращает на себя внимание следующее: по сравнению с группой 3 в группах 1 и 2 отмечалась более выраженная реакция неоангиогенеза и фиброгенеза на всех сроках, что свидетельствовало о пролонгированном раздражающем действии элементов импланта на ткани организма. По сравнению с группой 1 в группах 2 и 3 отмечались менее выраженные общие тканевые процессы на сроке 14 и 180 дней, при этом в группе 3 — более значимо. Таким образом, в группе 1 были более выражены процессы воспаления и клеточной инфильтрации. Группа 2 отличалась от тканевых реакций в группах 1 и 3. По сравнению с группой 3 отмечались более выраженные тканевые реакции (больший пул клеточных элементов, рост сосудов и формирование фиброзной ткани на всех сроках). По сравнению с группой 1 отмечалась менее выраженная воспалительная тканевая реакция на сроке 14 и 180 дней, при этом на сроке 60 дней (период резорбции части импланта) отмечалось преобладание количества сосудов и фиброплазии.

Обсуждение

В состав разработанной системы доставки лигатур для аксиальной фиксации структур тазового дна используются ранее известные и широко используемые материалы. Нерассасывающийся компонент сделан из полипропилена, который является самым распространённым материалом для производства имплантов в реконструктивной хирургии тазового дна у женщин [5]. Резорбируемая часть импланта выполнена в двух вариантах: из полидиоксанона и полиглекапрона. Данные соединения являются полиэфирами, деградация которых происходит за счёт гидролиза сложноэфирных связей, а продукты этого процесса полностью метаболизируются организмом [10]. Полидиоксанон был разработан в начале 1980-х годов и благодаря относительно длительной продолжительности деградации (182 – 238 дней) получил широкое распространение в производстве резорбируемых медицинских изделий, где необходим долговременный рассасывающийся материал [11]. Одними из таких изделий являются повсеместно используемые нити PDS («Ethicon, Inc», Johnson & Johnson Company, Cincinnati, OH, USA), Ультрасорб (Линтекс, Cанкт-Петербург, РФ).

Полиглекапрон был впервые использован в хирургии в 1993 году. Данный материал изготавливается из сополимера гликолида и ε-капролактона и представляют собой синтетический аналог кетгута, не вызывающий выраженных тканевых реакций. Период сохранения прочности составляет 21 – 28 дней. Срок полной резорбции нитей из полиглекапрона находится в диапазоне 60 – 90 дней. Распространённым шовным материалом из полиглекапрона являются нити Monocryl («Ethicon, Inc», Johnson & Johnson Company, Cincinnati, OH, USA), Моносорб (Линтекс, Cанкт-Петербург, РФ). Как полидиоксанон, так и полиглекапрон считаются неантигенными и апирогенными и вызывают минимальную реакцию тканей при резорбции после имплантации, что было также отмечено и в нашем исследовании. Таким образом, разработанные системы доставки лигатур Аксилен и Аксилен-Рапид выполнены из хорошо изученных и повсеместно используемых, безопасных материалов.

Очевидные недостатки нерезорбируемых сетчатых имплантов ранее сподвигли исследователей на поиски материалов для производства имплантов, снижающих потенциальные риски их применения.

В рамках исследования L. Hympanova et al. (1018) были разработаны и оценены импланты из поликапролактона и уреидопиримидинона, полученные путём электроспининга. Результаты показали, что их прочность недостаточна ввиду слишком ранней резорбции импланта [12]. Наличие нерассасывающихся лигатур в разработанной нами системе их доставки, предположительно, должно решить данную проблему. В свою очередь, исследование I.A. Eisenakh et al. (2020) сосредоточилось на сравнении физических и биомеханических характеристик разработанного для реконструктивной хирургии биополимера, состоящего из поликапролактона и политриметилена, синтезированного методом электроспиннинга, с полипропиленовым имплантом. Они обнаружили, что, хотя биополимер обладает свойствами, схожими с полипропиленом в плане растяжения и прочности на разрыв, он вызывает более интенсивный фиброз [13]. Напротив, результаты нашего исследования показывают, что процесс фиброза более выражен в группе с полипропиленовым имплантом. Исследование L. Yao et al. (2017) было посвящено разработке и оценке полилактидных вязаных резорбируемых имплантов для реконструкции тазового дна. При сравнении с полипропиленовым имплантом было выявлено, что полилактидные сетки превосходят их по показателям разрывной нагрузки в эксперименте in vivo [14]. Аналогичные данные были получены и в нашем эксперименте. В исследовании S. Roman et al. (2016) были оценены альтернативные материалы для хирургической коррекции ПТО и СНМ. Сравнивая реакцию организма и биомеханические свойства материалов после имплантации у кроликов, исследователи обнаружили, что импланты из поли-L-молочной кислоты и полиуретана лучше интегрировались в ткани хозяина и вызывали меньшую воспалительную реакцию, чем полипропиленовые и поливинилиденфторидные импланты [15]. Полученные в нашем эксперименте данные сопоставимы с данными результатами. Частично резорбируемые системы доставки лигатур Аксилен и Аксилен-рапид вызывают меньшую воспалительную реакцию на всех сроках имплантации.

С.С. Chen et al. (2007) ранее были сформулированы характеристики идеального импланта для реконструктивной хирургии тазового дна. К этим характеристикам относились химическая и физическая инертность, отсутствие канцерогенного эффекта, механическая прочность, стерильность, доступность и дешевизна, минимальный риск инфицирования и отторжения. В хирургии ПТО и СНМ оптимальный имплант после заживления должен восстанавливать нормальную анатомию и функцию тазового дна, а также быть более прочным или таким же, как собственная ткань. Процесс установки подобного импланта должен быть простым, выдерживать потенциальную механическую нагрузку и противостоять усадке [16].

Полученные данные подтверждают, что применение полипропилена в сочетании с резорбируемыми полимерами, такими как полиглекапрон и полидиоксанон, в системах доставки лигатур для реконструктивной хирургии тазового дна являются более безопасными и не менее эффективными в сравнении с нерезорбируемыми имплантами. Эти материалы, благодаря своим химическим свойствам и длительным срокам резорбции, обеспечивают необходимую поддержку в процессе заживления, при этом минимизируя риски, связанные с воспалением и отторжением, которые часто встречаются при использовании исключительно нерезорбируемых материалов.

Заключение

Разработанные импланты Аксилен и Аксилен Рапид соответствуют многим критериям идеального импланта, включая химическую и физическую инертность, механическую прочность и доступность. При этом они также способствуют восстановлению нормальной анатомии и функции тазового дна и демонстрируют устойчивость к механическим нагрузкам и усадке. Итоговые выводы о преимуществах разработанных систем доставки лигатур могут быть сделаны только после дополнительных рандомизированных клинических исследований, что позволит определить долгосрочную безопасность и эффективность имплантов.