Экспрессия экзосомальных микроРНК miR-34a и miR-210 при мужском бесплодии: связь с морфокинетическими параметрами и фрагментацией ДНК сперматозоидов

Введение

В современных условиях проблема снижения рождаемости и невозможность иметь ребёнка в каждой семье являются важными как для общества в целом, так и для благополучия отдельного человека. Существенная роль в этих процессах наряду с социально-экономическими факторами принадлежит бесплодию, которым страдают до 15% семейных пар [1 – 3]. При этом не менее половины всех зарегистрированных случаев связано с нарушением репродуктивной функции мужчин. Несмотря на совершенствование методов дифференциальной диагностики различных форм мужского бесплодия, включая молекулярно-генетические технологии, от 30 до 70% всех случаев обозначаются как идиопатические, то есть без установленной конкретной причины нарушения фертильности [4][5].

Сперматогенез — это контролируемый многоступенчатый процесс, в ходе которого образуются зрелые сперматозоиды. Нарушение сперматогенеза у мужчин может иметь различную этиологию и молекулярные механизмы, которые ещё предстоит выявить. Известно, что почти 2000 генов координируют сперматогенез [6]. Выявление причин их дисфункции, а также роли различных регуляторных молекул, включая микроРНК, является важнейшим предметом исследования современной андрологии.

МикроРНК (miRNAs) представляют собой тип некодирующих РНК длиной около 22 нуклеотидов, играющих существенную роль в реализации посттранскрипционных процессов. Изменения экспрессии микроРНК ассоциируют с качеством ооцитов, а также олиго-, астено- и тератозооспермией [7][8]. Изучение микроРНК является важной составляющей научных исследований, поскольку они циркулируют в различных биологических средах и достаточно легко обнаруживаются даже в низких концентрациях. МикроРНК выявляются намного раньше белковых маркеров, что позволяет диагностировать заболевание на ранней стадии. МикроРНК более стабильны, чем мРНК, поскольку защищены от действия эндогенных РНКаз и существуют в виде комплексов с различными белками или другими веществами [9]. В настоящее время микроРНК рассматриваются как эффективные модуляторы всех этапов репродуктивного процесса, включая гаметогенез, оплодотворение, имплантацию эмбриона, эмбриональное развитие и сохранение беременности [10][11].

Цель исследования: изучить роль экзосомальных микроРНК miR-34a и miR-210 сперматозоидов в развитии мужского бесплодия.

Материалы и методы

В ретроспективном исследовании приняли участие 150 мужчин в возрасте 25 – 49 лет, которые наблюдались в медицинском центре «Семья» г. Уфы, из них 96 пациентов были с диагнозом «Идиопатическое мужское бесплодие». Средний возраст обследованных составил 32,3 ± 3,6 года. В группу сравнения вошли 54 фертильных мужчины. Все участники подписали форму информационного согласия. Процедуры исследования одобрены локальным этическим комитетом.

Обследуемые сдавали эякулят после двухдневного полового воздержания. Исследуемые образцы хранили при температуре -80 °С не более 3 месяцев. Соблюдены все принципы предварительной подготовки к сдаче спермы. Все обследуемые предварительно прошли анкетирование. Критериями отбора пациентов стали: возраст от 20 до 50 лет, отсутствие тяжёлых соматических заболеваний, детей и вредных привычек. Критерии исключения — тяжёлая соматическая патология, заболевания яичек и их придатков, наличие варикоцеле. Кроме того, в работе были использованы дополнительные результаты обследования для включения в исследование, в которых учитывались сведения о гормональном статусе пациента (ФСГ, ЛГ, тестостерон, пролактин), данные инструментальных методов (трансректального ультразвукового исследования простаты, УЗИ мошонки) и классическая спермограмма.

Для оценки структуры и подвижности сперматозоидов использовали результаты стандартного исследования эякулята, проводимого специалистом в ручном режиме, а также компьютерного анализа методом Computer Assisted Sperm Analysis System (CASA). В анализе CASA применялось программное обеспечение MMC Sperm (MMCSoft, Санкт-Петербург, РФ). Изучались такие параметры, как скорость криволинейного (VCL) и прямолинейного движений (VSL), скорость движения по среднему пути (VAP); амплитуда бокового смещения головки сперматозоида (ALH); линейность криволинейного пути (LIN); степень отклонения фактической траектории относительно усреднённой (WOB); частота, с которой криволинейная траектория пересекала средний путь движения сперматозоидов (BCF); показатель прямолинейно направленных движений (STR). Оценка степени фрагментации ДНК осуществлялась методом TUNEL (The terminal deoxynucleotidyl-transferase-mediated dUTP nick end labeling assay). Для подсчёта доли клеток с повреждённой ДНК использовали проточную цитометрию на аппарате Beckman Coulter Navios Flow Cytometer.

Основной этап работы заключался в исследовании процессов экспрессии miR-210 и miR-34а, ассоциированных со сперматогенезом, в том числе у пациентов с повторными неудачными исходами ВРТ. Этот этап исследования выполнен в Институте урологии и клинической онкологии Башкирского государственного медицинского университета.

Для анализа экспрессии miR-34a, miR-210 проводили количественную ПЦР в реальном времени с использованием набора miRCURY LNA SYBR Green PCR Kit («Qiagen» GmbH, Hilden, Germany) и системы обнаружения продуктов ПЦР в реальном времени Rotor-Gene Q («Qiagen» GmbH, Hilden, Germany). В качестве эндогенного контроля использовали микроРНК-16 и микроРНК-1228, а также синтетические молекулы UniSp2, UniSp4, UniSp5, UniSp6. Синтетическую cel-микроРНК-39 использовали для экзогенного контроля выделения, обратной транскрипции и амплификации («Qiagen» GmbH, Hilden, Germany). Для интерпретации полученных результатов применён биоинформатический анализ 2^–∆∆Ct. В основе этого метода лежит положение о том, что разница в величине «порогового цикла» (∆Ct) — цикла, в котором наблюдалась детектируемая флюоресценция между интересующим и контрольным геном, пропорциональна уровню относительной экспрессии интересующего гена.

Статистический анализ. Для статистической обработки данных применялось программное обеспечение Pandas Python Data Analysis Library, для визуализации результатов — Plotly Python Open Source. При расчётах показателей использовано программное обеспечение Python 10.3 (Python Software Foundation, Delaware, DE, USA) пакет SciPy v1.11.4. Количественные показатели представлены в виде средних (M) ± стандартным отклонением (SD) или в виде частот / долей (%). После проведения проверки на нормальность распределения показателей с помощью теста Shapiro-Wilk была использована ранговая корреляция Spearman для выявления взаимозависимых величин. Сила корреляционных связей оценивалась по шкале Chaddock. Уровень достоверности различий — р < 0,05.

Результаты

Формы патологии у мужчин с бесплодием представлены в таблице 1. Из неё видно, что основной контингент составили пациенты с диагнозом «идиопатическое бесплодие». В таблице 2 представлены показатели спермограмм пациентов с идиопатическим бесплодием и фертильных мужчин контрольной группы.

Бесплодные пациенты и фертильные мужчины статистически достоверно отличались по показателям концентрации и содержания аномальных сперматозоидов в эякуляте и не имели статистически значимых различий по его объёму и содержанию прогрессивно-подвижных клеток. В настоящее время имеются многочисленные сведения о том, что данные спермограммы не несут надёжной информации о возможности зачатия ребёнка. В связи с этим в нашей работе был использован метод компьютерного анализа кинетических свойств сперматозоидов (CASA), который характеризуется высокой объективностью и репрезентативностью [12][13].

На рисунке 1 показана взаимосвязь степени фрагментации ДНК и уровня прогрессивной подвижности сперматозоидов. Полученные данные были проанализированы с использованием метода ранговой корреляции Spearman.

Нами выявлена группа параметров, имеющих значимую корреляционную связь с процессом ДНК-фрагментации. Так, прогрессивная подвижность сперматозоидов была обратно пропорциональна степени повреждения генетического материала (r = -0,411547; р < 0,01) (рис. 1). Это корреспондирует с данными других авторов [14][15]. Сила обратной связи по шкале Chaddock оценивалась как умеренная.

Из определяемых с помощью компьютерного анализа показателей эякулята достоверно значимую ассоциацию с уровнем фрагментации ДНК сперматозоидов имели VCL, VSL, VAP, ALH, LIN и STR. Результаты представлены в таблице 3.

Наиболее сильная корреляционная связь уровня фрагментации ДНК сперматозоидов выявлена с показателем их прямолинейной скорости движения — VCL (r = -0,522726; р < 0,01). Согласно шкале Chaddock сила ассоциации оценивалась как умеренная. К параметрам с умеренной корреляционной связью относились также скорость криволинейного пути (r = -0,499096; р < 0,01) и скорость движения по среднему пути (r = -0,429533; р < 0,01), а среди производных параметров — линейность криволинейного пути (r = -0,385796; р < 0,01). В то же время такие параметры, как ALH и STR, хоть и обладали значимой корреляционной связью (r = -0,294779; р < 0,01 и r = -0,268248; р < 0,05 соответственно), характеризовались слабой силой ассоциации.

В целом приведённые выше данные дают основания для рекомендации использования морфокинетических параметров CASA в качестве прогностического критерия степени фрагментации ДНК сперматозоидов для оценки их оплодотворяющей способности.

На следующем этапе исследования были изучены различные аспекты регуляции фрагментации ДНК (SDF), ассоциированные с молекулярными механизмами репарации ДНК и контроля экспрессии её генов, которые, в свою очередь, зависят от профиля микроРНК. Оплодотворение яйцеклетки сперматозоидом низкого качества приводит к необратимым молекулярным изменениям у потомства, поскольку имеется прямая корреляционная связь между качеством спермы, эффективностью оплодотворения и развитием эмбриона [16].

Основными достоинствами метода выявления микроРНК сперматозоидов являются высокая чувствительность, стабильность, строгая специфичность, сравнительная лёгкость исполнения и возможность раннего обнаружения как диагностического маркера. Исходя из этого детекция уровня микроРНК может представлять собой идеальный инструмент для быстрой и неинвазивной диагностики многочисленных форм патологии, включая мужское бесплодие [17].

На рисунках 2 и 3 представлено графическое изображение полученных нами результатов уровней экспрессии микроРНК-34а и микроРНК-210 в группах обследованных мужчин.

У пациентов с идиопатическим бесплодием обнаружено значимое снижение экспрессии микроРНК-34а (р = 0,0116) и повышение экспрессии микроРНК-210-3p при низкой степени достоверности (р = 0,2877) этих изменений. Согласно шкале Chaddock, сила корреляционной связи между экспрессией miR-210-3p и эффективностью программ ВРТ в этой когорте оценивалась как умеренная (p = 0,437993), в то время как обратная зависимость экспрессии miR-34a с результатами ЭКО/ИКСИ характеризовалась как слабая (p = 0,135314). Близкие по характеру ассоциации были установлены между степенью SDF и экспрессией изученных нами микроРНК в когорте бесплодных мужчин.

Обсуждение

Метод CASA позволяет оценить различные показатели прямолинейного и криволинейного движения гамет, включая его амплитуду, скорость и траекторию. Кроме того, этот метод имеет преимущество в сравнении с оценкой рутинной спермограммы при изучении таких показателей, как относительное содержание непрогрессивно подвижных и неподвижных сперматозоидов в качестве критериев степени повреждения их ДНК. По нашим данным, доля таких сперматозоидов прямо пропорциональна степени ДНК-фрагментации (r = 0,50, p < 0,001). Прогностическая ценность параметра достигает 77 – 78%. В ходе исследования установлена также отрицательная корреляция между фрагментацией ДНК и такими параметрами, как VCL, VSL, VAP, ALH, LIN и STR.

Похожие результаты были получены группой H. Lin et al. (2022) [14]. В работе была показана значимая обратная связь показателя фрагментации ДНК сперматозоидов с базовыми параметрами CASA (VCL, VSL, VAP и ALH), но не выявлено корреляции с производными величинами LIN и STR. Авторами также было показано, что совместное использование морфокинетических показателей CASA, рутинного анализа морфологии клеток и оценки SDF значительно повышает прогностическую способность исследования и в большинстве случаев является оптимальным индикатором мужской фертильности. Низкий (физиологический) уровень ДНК-фрагментации, по данным большинства исследований, сочетается, как правило, с высокими значениями кинетических показателей компьютерного мониторинга (VAP, VCL, VSL и STR), что согласуется с полученными нами данными.

Важно отметить, что различные стороны регуляции целостности ДНК сопряжены с аберрантной экспрессией множества различных микроРНК, каждая из которых имеет несколько мишеней со множеством сайтов связывания для одних и тех же или разных микроРНК [17]. Следовательно, разные пулы микроРНК могут проявлять синергические эффекты при одних и тех же физиологических процессах, и определённые микроРНК играют существенную роль на различных стадиях сперматогенеза. Инициация мейотической фазы сперматогенеза требует, чтобы мужские половые клетки вышли из митоза и быстро экспрессировали гены, регулирующие мейоз. Выполненная в настоящем исследовании валидация экспрессии микроРНК-34а продемонстрировала статистически значимое изменение в группе бесплодных мужчин по сравнению с индивидами контрольной группы. МикроРНК-34а является необходимой для правильного формирования, а также надлежащего функционирования сперматозоидов, и, кроме того, обладает значительными антиоксидантными и антиапоптотическими свойствами, способствуя, таким образом, регуляции гомеостаза яичек [7][11].

Согласно нашим и литературным данным, у пациентов с нарушением фертильности значительно увеличена экспрессия miR-210-3p по сравнению с мужчинами без патологии спермограммы. Считается, что увеличение экспрессии miR-210 сопровождается активацией каспазы-3, что приводит к апоптозу [18], а также нарушениям регуляции сперматогенеза, дефектам строения аксонемы сперматозоидов с высокой вероятностью снижения их активности. МикроРНК наряду с другими факторами [19] играют также ключевую роль в возрастных изменениях мужской фертильности, то есть являются медиаторами репродуктивного старения, о чём свидетельствует анализ профилей экспрессии микроРНК сперматозоидов мужчин разного возраста с нормальной фертильностью [20].

Заключение

Результаты настоящего исследования позволяют сделать вывод о том, что имеется статистически значимая связь между процессом фрагментации ДНК сперматозоидов и такими кинетическими параметрами, как прогрессивная подвижность, прямолинейная скорость движения, скорость движения по среднему пути и скорость криволинейного движения. Результаты биоинформационного анализа микроРНК-34а и микроРНК-210, регулирующих физиологические процессы в сперматозоидах, имеют тесную связь с изменением их кинетических и морфологических параметров, а также с процессом фрагментации ДНК сперматозоидов.

Ключевые моменты

• Показатели экспрессии микроРНК-34а и микроРНК-210 существенно различаются у бесплодных пациентов и мужчин с доказанной фертильностью, а также у пациентов с повторными неудачными и успешными исходами процедуры ВРТ.
• Нарушение экспрессии семейств miR-34а/210 отрицательно влияет на репродуктивный потенциал мужчин.
• Результаты мониторирования количественных и структурных изменений экзосомальных микроРНК сперматозоидов могут служить чувствительными биомаркерами при проведении индивидуальной диагностики мужского бесплодия, а также при оценке его тяжести.