Сравнительная оценка биодоступности компонентной смеси ботулотоксина А и тизоля с раствором ботулотоксина А для слизистой мочевого пузыря в эксперименте

Введение

Мочевой пузырь является полым мышечным органом и выполняет две основные задачи: накопление мочи (большую часть времени без повышения внутрипузырного давления) и выведение мочи. Внутренняя поверхность мочевого пузыря выстлана переходно-клеточной эпителиальной оболочкой — уротелием, который выполняет важную функцию хранения мочи в течение длительного периода времени, сохраняя при этом её состав, аналогичный составу мочи, выделяемому почками [1].

Уротелий состоит из трёх слоёв: слой базальных клеток, промежуточно-клеточный слой и слой зонтичных клеток [2]. Слой зонтичных клеток является единственным уротелиальным слоем, который образует плотные адгезионные соединения, отвечающие за барьерную функцию [3]. Этот барьер сложный и включает в себя три компонента: апикальный, латеральный и базальный. Апикальный мембранный барьер состоит из белков уроплакинов, которые собраны в гексагональные уротелиальтные бляшки. Уротелиальная бляшка представляет до 90% поверхности просвета и придает трансцеллюлярную резистентность, ограничивая проницаемость для воды, растворённых веществ и токсинов [4]. Плотные соединения зонтичных клеток образуют латеральный барьер [5]. Апикальные соединения представляют собой специализированные эпителиальные структуры; как отличительная черта поляризованных эпителиальных клеток, они играют решающую роль в регуляции парацеллюлярного транспорта [2]. Мембраны эпителиальных клеток образуют барьер для макромолекул и гидрофильных растворов, включая ионы и воду; однако эти молекулы потенциально могут перемещаться по парацеллюлярному пути в клеточных соединениях. Адгезивные соединения и десмосомы имеют решающее значение для связи межклеточной адгезии с актиновыми или промежуточными филаментами цитоскелета и соединения соседних эпителиальных клеток. Тем не менее эти соединения не закрывают парацеллюлярный путь, так как он контролируется плотными соединениями, компонентом апикального соединительного комплекса, граничащего с просветом [6].

Несмотря на непроницаемость апикальной мембраны, уротелий экспрессирует белки аквапорины, которые могут переносить небольшое количество различных веществ [7].

Хотя исторически уротелий рассматривался в первую очередь как «барьер», его всё чаще оценивают как реагирующую структуру, способную обнаруживать физиологические и химические стимулы, высвобождая ряд сигнальных молекул. Данные, накопленные за последние несколько лет, показывают, что уротелиальные клетки обладают рядом свойств, сходных с сенсорными нейронами (ноцицепторами / механорецепторами) и что оба типа клеток используют различные механизмы передачи сигналов для обнаружения физиологических стимулов [8]. Уротелий экспрессирует различные виды рецепторов: холинергическе, пуринергические, адренергические, а также кислотночувствительные ионные каналы, каналы временного рецепторного потенциала. Экспрессия этих рецепторов и ионных каналов позволяет уротелию реагировать на различные стимулы из различных источников [2]. Кроме того, уротелий может сам секретировать сигнальные молекулы, которые включают в себя нейротрофины, нейропептиды, АТФ, ацетилхолин, простагландины, оксид азота и цитокины [9 – 11]. Эти сигнальные молекулы могут взаимодействовать с другими клетками, такими как нейроны, гладкомышечные клетки, интерстициальные клетки [10][12]. Было показано, что во время наполнения мочевого пузыря или болей происходит выработка АТФ и его связывание с пуринергическими рецепторами [12]. Кроме сигнальных молекул и рецепторов, в уротелии существует множество каналов временного рецепторного потенциала (TRP) [2]. Эти каналы имеют специфическое распределение в тканях и активируются различными экзогенными и эндогенными медиаторами [13][14], и они играют очень важную функциональную роль в мочеиспускании [15]. Нарушение функции каналов TRP может быть связано с синдромом гиперактивного мочевого пузыря и интерстициального цистита [16][17]. Одним из примеров уротелиальной сенсорной молекулы является TRP-канал TRPV1 (ванилоидный), который, как известно, играет заметную роль в ноцицепции и функции мочевого пузыря [18]. Внутрипузырное введение ванилоидов (капсаицина или резинифератоксина) улучшает уродинамические показатели у больных с нейрогенной гиперактивностью детрузора и уменьшает боль в мочевом пузыре у пациентов с явлениями гиперчувствительности [19][20].

Хотя уротелий поддерживает плотный барьер для потока ионов и растворённых веществ, ряд факторов, таких как pH ткани, механическая или химическая травмы, бактериальная инфекция, могут модулировать эту барьерную функцию [21][22]. Некоторые агенты способны глубоко проникать в слизистую и мышечную оболочку мочевого пузыря и играть роль проводников увеличивая пенетрантность лекарственных веществ в ткани без потери их эффективности. Одним из веществ, которое может модулировать проницаемость уротелия, может быть, глицеросольват титана (тизоль) [23].

Для лечения синдрома гиперактивного мочевого пузыря, согласно Российским и Европейским Клиническим Рекомендациям, показано использование ботулотоксина типа А (БоТ-А) [24][25]. Согласно этим Рекомендациям, производится инъекционное введение БоТ-А в стенку мочевого пузыря. Для поддержания длительного клинического эффекта, как правило, требуются повторные периодические инъекции препарата. При этом очевидным недостатком метода является его инвазивность и необходимость анестезиологического пособия. Разработка менее инвазивного способа введения БоТ-А позволило бы существенно расширить возможности коррекции синдрома гиперактивного мочевого пузыря.

Цель исследования: определить влияние тизоля на биологическую доступность БоТ-А в слизистую мочевого пузыря, сравнение биодоступности с сепаратным введением БоТ-А.

Материалы и методы

С целью увеличения биодоступности БоТ-А была приготовлена смесь, состоящая из 40% тизоля и 60% раствора 1 флакона препарата Релатокс, представляющего собой токсин БоТ-А в комплексе с гемагглютинином в 0,9% растворе натрия хлорида.

В состав содержимого 1 флакона «Релатокс» входят следующие компоненты:

• комплекс БоТ-А с гемагглютинином — 50 ЕД;
• желатин — 6 мг;
• мальтоза — 12 мг.

В качестве экспериментальной модели для изучения изменения биодоступности БоТ-А в комплексе с тизолем в эксперименте in vitro, использовали модель диализа через слизистую оболочку мочевого пузыря телёнка ввиду морфологической идентичности строения мочевыводящей системы у млекопитающих (рис. 1). С этой целью отделяли слизистую оболочку от мышечной ткани изолированного мочевого пузыря (рис. 2) и вырезали лоскуты размером 6 × 5 см.

Полученные лоскуты слизистой проверяли под лупой на целостность (рис. 3), укладывали между двумя салфетками, обильно смоченными 0,9% раствором натрия хлорида, переносили в чашку Petri и использовали в срок не более чем 30 минут после получения биологического материала.

Для определения биологической доступности БоТ-А применяли метод равновесного диализа по Крувчинскому в диализаторе с диаметром стеклянной трубки 3,0 ± 0,2 см, на которой размещали лоскуты слизистой оболочки (рис. 4).

Объём акцепторной среды, в качестве которой использовали термостатированный при 37 ± 0,5º С 0,9% раствор натрия хлорида, составлял 50,0 мл, точно отмеренный пипеткой.

На внутреннюю часть слизистой оболочки наносили исследуемые образцы. Приборы для диализа выдерживали в термостате при температуре 37 ± 0,5º С. Пробы акцепторной среды в количестве 1,0 мл отбирали пипеткой через каждый час эксперимента в течение 24 часов. Объём отобранной аликвоты немедленно восполняли термостатированным раствором натрия хлорида 0,9% (рис. 5).

Для определения содержания БоТ-А в акцепторной среде применяли метод УФ-спектрофотометрии.

Для приготовления исследуемых образцов точную массу содержимого флакона препарата Релатокс в количестве 0,0169 г помещали в мерную колбу вместимостью 5 мл и доводили водой очищенной (вода) до метки (раствор А). К отмеренным пипеткой 2 мл раствора А прибавляли точно отвешенные 10,0 г тизоля и перемешивали в ступке до получения однородной смеси (образец 1). Исследуемый образец 2 представлял собой раствор А.

В качестве контрольного образца использовали диализные трубки с размещённой на них интактной слизистой оболочкой.

Приготовление реактива Benedict:

1. раствор I — к 50,0 мл воды очищенной прибавляли 17,3 г натрия цитрата, 10,0 г натрия карбоната и растворяли, подогревая, но не доводя до кипения;
2. раствор II — 1,73 г меди сульфата растворяли в 10,0 мл воды очищенной;
3. раствор III — готовили смесь растворов I и II.

Объём смеси доводили до 100,0 мл водой очищенной. Приготовление раствора стандартного образца: 0,32 мл раствора А помещали в мерную колбу вместимостью 5,0 мл, прибавляли 2,0 мл 6% раствора натрия гидроксида, 0,2 мл реактива Benedict и доводили объём раствора в колбе водой, очищенной до метки.

На внутреннюю часть слизистой оболочки, размещенную на диализной трубке, наносили 1,0000 г смеси БоТ-А с тизолем (образец 1); 1,0 мл раствора А (образец 2).

Отобранные аликвоты переносили в мерные колбы вместимостью 10,0 мл, прибавляли 2,0 мл 6% раствора натрия гидроксида, 0,2 мл реактива Benedict и доводили объём раствора в колбе водой, очищенной до метки. Полученные растворы выдерживали в течение 15 минут при комнатной температуре и определяли оптическую плотность относительно раствора сравнения.

Раствор сравнения готовили аналогично исследуемым растворам, используя аликвоту акцепторной среды контрольного образца.

УФ-спектры получали с использованием спектрофотометра Shimadzu-1240 UV mini, (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan) в области 200 – 400 нм с шагом дискретизации 1 нм в кварцевых кюветах с толщиной слоя 10 мм.

Все растворы перед спектрофотометрическим определением фильтровали через бумажный фильтр «синяя лента».

Расчёт содержания БоТ-А в % от внесённого количества проводили по стандартному образцу, по формуле:

где: а_ст — масса БоТ-А, г;

а_х — объём аликвоты исследуемого образца, мл;

V_ст — объём аликвоты стандартного образца, мл;

V_х — объём аликвоты исследуемого образца, мл;

W — объёмы мерных колб, мл;

А_х — оптическая плотность исследуемого раствора;

А_ст — оптическая плотность раствора стандартного образца.

Образцы УФ–спектров представлены на рисунке 6.

В соответствии с полученными результатами строили кривые диализа в системе координат: время — содержание БоТ-А, прошедшего через слизистую оболочку, выраженное в процентах от внесенного количества (рис. 7). Далее выполняли расчёт площади под кривой 1 и под кривой 2. Расчёт проводился в программе Microsoft Excel 365.

Результаты

Установлено, что максимальное количество БоТ-А диффундировало в акцепторную среду смеси исследуемого вещества с тизолем через 9 часов эксперимента и затем оставалось постоянным (76,7%) от внесённого количества на протяжении всего времени исследования.

Кривая диализа БоТ-А на начальном этапе имеет форму гиперболы, что существенно уменьшает площадь под кривой и свидетельствует о низкой скорости диффузии фармакологически активного вещества. Однако через 8 часов диализа кривая приобретает форму параболы, а через 24 часа концентрация БоТ-А в диализате составляла уже 84,3% от внесенного количества препарата.

Тем не менее, сравнительный анализ площади под кривой интактного БоТ-А (4854 мм²) и диализа смеси БоТ-А с тизолем (5952 мм²), показывает, что площадь под кривой смеси БоТ-А с тизолем на 1098 мм² (18,45%) больше, что свидетельствует об улучшении биологической доступности препарата в присутствии тизоля.

Обсуждение

Лечение синдрома гиперактивного мочевого пузыря является сложной задачей. Терапия пероральными препаратами, к сожалению, не всегда приводит к желаемому результату, и большинство пациентов отказывается от предложенной терапии ввиду малоэффективности и наличия побочных эффектов и / или высокой стоимости лечения [26]. Ботулинотерапия показала свою высокую эффективность, но требует внутридетрузорного введения БоТ-А каждые 6 – 9 месяцев, и для его введения необходимо стационарные условия [27]. Инстилляция БоТ-А не приводит к успеху ввиду большой массы молекулы и наличия барьерных функций у уротелия. В пилотном исследовании H.C. Kuo et al. (2014) показали эффективность инстилляции БоТ-А с липосомами при синдроме гиперактивного мочевого пузыря [28]. Однако последующие работы этих авторов показали малоэффективность смеси, но изменение концентрации БоТ-А и продолжительности инстилляции могут улучшить результат [29]. Использование проводников-инхансеров, которые могут изменить проницаемость уротелия, позволит уменьшить инвазивность процедуры при введении БоТ-А. Тизоль сам приникает в ткани и увеличивает проницаемость. Проведено несколько исследований, указывающих на высокую проникающую способность тизоля в стенку мочевого пузыря. Данные исследования проводились для улучшения результатов внутрипузырной инстилляционной химиотерапии больных раком мочевого пузыря. Для оценки распределения препарата в стенке мочевого пузыря после внутрипузырных инстилляций тизоля в виде водного 40% раствора определяли содержание титана как в слизистой, так и в мышечной оболочке органа. В результате исследования было показано, что концентрация титана в различных слоях мочевого пузыря изменялась в зависимости от характеристик исследуемого материала. Титан обнаруживался в стенке мочевого пузыря и тех в случаях, когда тизоль в пузырь не вводился. Но концентрация титана в слизистой оболочке мочевого пузыря у пациентов после инстилляций тизоля в среднем составила 1,7 мкг/г и была примерно в 30 раз выше, чем у больных, которым не проводилось его инстилляций (0,055 мкг/г). После введения тизоля концентрация титана в мышечной оболочке составила в среднем 0,7 мкг/г и была почти в 63 раза выше, чем у больных без инстилляций (0,011 мкг/г). Концентрация титана в стенке мочевого пузыря снижалась с увеличением глубины забора материала. У больных, которым не проводились инстилляции тизоля, наибольшая концентрация титана фиксировалась в слизистой оболочке и в среднем приблизительно в 5 раз превышала его концентрацию в мышечной оболочке. После инстилляций тизоля наибольшая концентрация титана также наблюдалась в слизистой оболочке и была в среднем в 2,4 раза выше, чем в мышечной оболочке. Таким образом, результаты исследования указывают на фоновое наличие титана в стенке мочевого пузыря. При этом его концентрация в слизистой в среднем в 5 раз выше, чем в мышечной оболочке. Внутрипузырные инстилляции тизоля приводили к значительному увеличению концентрации титана в слизистой (в 30 раз) и мышечной (в 60 раз) оболочках, что указывает на глубокое проникновение препарата во все слои стенки мочевого пузыря [23]. Проведённые ранее работы позволили нам предположить о возможном увеличении биодоступности БоТ-А под воздействием тизоля. В проведённом нами исследовании оценивалась проникающая способность чистого БоТ-А и смеси БоТ-А с проводником-инхансером, 40%-ным раствором тизоля. При сравнении диализных кривых БоТ-А сам минимально проникает через слой уротелия, а под воздействием тизоля проницаемость уротелия увеличивается, что свидетельствует увеличение площади под кривой смеси БоТ-А с 40% раствора тизоля по сравнении площадью под кривой чистого БоТ-А почти на 18,45%. Полученные данные свидетельствуют об увеличении биодоступности препарата.

В данном исследовании использовалась смесь, состоящая из 40% тизоля и 60% раствора БоТ-А, содержащая 50 ЕД, и не проводилось исследование с растворами других концентраций Бот-А и тизоля. Планируется проведение дальнейших исследований по подбору соотношений в растворе тизоля и БоТ-А.

Заключение

Компонентная смесь тизоля и БоТ-А обладает большей биологической доступностью, чем сепаратный раствор БоТ-А. Полученная скорость диффузии исследуемой компонентной смеси через выбранную биологическую мембрану оказалась относительно низкая. Модификация проницаемости уротелия под воздействием тизоля способствует увеличению биодоступности БоТ-А и позволит перейти от инъекционного способа введения БоТ-А к внутрипузырным инстилляциям. Это будет иметь очень важное практическое значение, так как уменьшиться инвазивность процедуры, а вследствие этого количество возможных инфекционных осложнений, эпизодов задержки мочи, а также анестезиологических рисков, так как данная процедура может выполнятся в амбулаторных условиях. Планируются дальнейшие исследования для определения возможности увеличения скорости диффузии за счёт подбора соотношения тизоля и БоТ-А.