Патоморфологические изменения эякулята, выявленные электронной трансмиссионной микроскопией у пациентов с инфертильностью, ассоциированной с вирусом папилломы человека

Введение

Вирус папилломы человека (ВПЧ) является одним из наиболее распространённых вирусных заболеваний, передающихся половым путём. ВПЧ представляет собой ДНК-содержащий вирус, поражающий плоский эпителий репродуктивной системы нижних мочевых путей, зону анальной трансформации, эпителий слизистой оболочки гортани, миндалин и ротоглотки [1][2].

Заболеваемость ВПЧ относительно высока среди представителей обоих полов, независимо от социально-экономического статуса и географического положения. Вирус в зависимости от типа ответственен за формирование доброкачественных образований (бородавок или папиллом) и интраэпителиальной неоплазии, которые в сочетании со специфическими и близкородственными факторами риска, такими как курение, множественные половые партнёры, заболевания, передаваемые половым путём, могут привести к канцерогенезу и инфекционно-воспалительным заболеваниям нижних мочевыводящих путей [3 – 6].

Кроме того, исследования последних лет предлагают связь между ВПЧ и снижением фертильности и репродуктивного потенциала [7 – 9].

ВПЧ может поражать партнёров как женского, так и мужского пола. Имеются сообщения о более высоком уровне инфицирования ВПЧ бесплодных пар по сравнению с населением в целом (20,9% против 8,2%). Также имеется корреляция между частотой невынашивания беременности и наличием ДНК ВПЧ у партнёра-мужчины бесплодных пар по сравнению с неинфицированными парами (66,7% против 15% соответственно) [3][10].

Доказано, что частота беременностей снижается, а частота выкидышей увеличивается после инфицирования ВПЧ как женщин, так и мужчин [3][11].

В последние годы ряд исследований показали, что инфекция ВПЧ может вызывать изменение параметров эякулята, что, возможно, является одной из причин олигозооспермии и астенозооспермии у пациентов с инфертильностью, ассоциированной с ВПЧ [12][13].

Несмотря на большой накопленный опыт причастности ВПЧ к развитию инфертильности, остается достаточно много вопросов о корреляции типа вируса и различных форм патоспермии при инфертильности, ассоциированной с ВПЧ. Практически нет данных о тяжести и характере морфологических нарушений эякулята при наличии в нем ВПЧ [14 – 16].

Цель исследования. Изучить методом электронной микроскопии морфологические изменения эякулята пациентов с инфертильностью, ассоциированной с вирусом папилломы человека.

Материалы и методы

Проведён анализ результатов электронно-микроскопического исследования эякулята у 51 пациента в возрасте от 22 до 40 лет (средний возраст 32,3 ± 6,4) с диагнозом бесплодие и патоспермия, сочетающееся с ПВИ, но с отсутствием других факторов риска.

Критерии включения в исследование: возраст старше 18 лет, диагноз «Бесплодие», установленный на основании неспособности здоровой партнерши забеременеть в течение 1 года при регулярном сексе без контрацепции, положительный результат полимеразной цепной реакции (ПЦР) на ВПЧ, согласие пациентов на участие в исследовании.

Критерии невключения в исследование: другие ЗППП, инфекционно-воспалительные заболевания репродуктивных органов бактериальной этиологии (простатит, везикулит, орхит, уретрит), инфравезикальная обструкция (стриктура уретры, нейрогенная дисфункция нижних мочевых путей и другие), сопутствующая сердечно-сосудистая, неврологическая, эндокринная, системная и др. патологии, онкологические заболевания в настоящее время или в анамнезе, гормональные нарушения со стороны репродуктивной системы, аномалии со стороны мочевыводящих путей и репродуктивных органов, любое иммунодефицитное состояние.

Материалом для исследования служил эякулят. Образцы эякулята, полученные путём мастурбации после полового воздержания в течение 3 – 4 дней, были собраны в специальный стерильный контейнер. После разжижения при комнатной температуре оценивали концентрацию, подвижность и нормальную морфологию сперматозоидов в соответствии с рекомендациями Всемирной организации здравоохранения по анализу спермы (2021). Аликвоту общей спермы каждого пациента отправляли в клиническую и морфологическую лаборатории.

Для электронной микроскопии нативный материал эякулята фиксировали в 2,5%-ном глютаровом альдегиде (“AppliChem GmbH”, Darmstadt, Germany) в течение суток. После фиксации материал трёхкратно (по 15 мин.) промывали в фосфатном буфере. После обработки в буферах исследуемые образцы помещали в 1% раствор OsO4 (“AcrosOrganics^TM”, Fisher Sci, Geel, Antwerp, Belgium) на фосфатном буфере pH 7,2 – 7,4 на 1,5 часа, затем обезвоживали в спиртах восходящей концентрации и ацетоне, заключались в эпоксидную смолу Эпон®-812 ‘Ероху Embedding Medium’ (“Sigma-Aldrich”, Burlington, MA, USA) плоскопараллельным методом и полимеризовались при 60º. Полученные блоки из эпоксидной смолы вытачивались на высокоскоростной фрезе Leica EM TRIM для получения полутонких срезов, окрашенных толуидиновым синим. Блоки из эпоксидной смолы, подвергались ультрамикротомии алмазным ножом на ультрамикротоме «Ultracut-UC6» (“Leica Microsystems GmbH”, Wetzlar, Germany). Толщина ультратонких срезов составляла 70 нм. Для контрастирования срезы обрабатывали 1,5% раствором уранилацетата на 70º этаноле и цитратом свинца. После контрастирования срезы просматривали в трансмиссионном электронном микроскопе «Jem 1011» (“JEOL Ltd.”, Akishima, Tokyo, Japan) с помощью цифровой камеры «Erlangshen ES500W» (“Gatan, Inc.”, Pleasanton, CA, USA). Измерение размеров ультраструктур осуществляли в абсолютных единицах (мкм и нм). При необходимости проводили морфометрию ультраструктур с помощью программного обеспечения «DigitalMicrograph ®» (“Gatan, Inc.”, Pleasanton, CA, USA). Для идентификации типа вируса использовали амплификационный метод ДНК-диагностики ПЦР. Анализ охватывал все известные в настоящее время генотипы как высокого онкогенного риска (ВПЧ-16, ВПЧ-18, ВПЧ-26, ВПЧ-31, ВПЧ-33, ВПЧ-35, ВПЧ-39, ВПЧ-45, ВПЧ-51, ВПЧ-52, ВПЧ-53, ВПЧ-56, ВПЧ-58, ВПЧ-59, ВПЧ-64, ВПЧ-66, ВПЧ-67, ВПЧ-68, ВПЧ-69, ВПЧ-70, ВПЧ-73, ВПЧ-82), так и низкого онкогенного риска (LR-ВПЧ), (ВПЧ-6, ВПЧ-11, ВПЧ-40, ВПЧ-42, ВПЧ-43, ВПЧ-44, ВПЧ- 54, ВПЧ-55, ВПЧ-61, ВПЧ-62, ВПЧ-71, ВПЧ-72, ВПЧ-81, ВПЧ-83, ВПЧ-84, ВПЧ-87, ВПЧ-89, ВПЧ-90). Различие между генотипами высокого и низкого риска основано на классификации Международного агентства по изучению рака на основании ПЦР.

Статистический анализ. Для проведения статистического анализа полученные данные заносили в электронные таблицы Microsoft Office Excel 2007 (“Microsoft Corp.”, Redmond, WA, USA), а их обработку проводили с использованием пакета программы STATISTICA 6.1 (“StatSoft Inc.”, Tulsa, OK, USA). Определены частотные показатели (%) детекции ВПЧ в биоматериале.

Результаты

При анализе эякулята среди различных вариантов патозооспермии чаще выявлялись астенозооспермия (35,3%) и астенотератазооспермия (31,4%), а процент олигоастенотератазооспермии и олигоастенозооспермии составлял 19,6% и 13,7% соответственно. У всех пациентов в эякуляте выявлены различные типы ВПЧ, из 20 идентифицированных вирусов 17 (85,0%) относились к вирусам высокого онкогенного риска (рис. 1).

В структуре ВПЧ доминировали вирусы 18 (33,3%), 16 (31,3%) 31 (27,4%) и 33 (21,5%) типов. Реже обнаруживали вирусы 6 и 11 типов (по 11,7%). Удельный вес остальных вирусов был достоверно ниже (p < 0,05).

Важным обстоятельством полученных результатов было то, что в 88,2% случаев в эякуляте регистрировали ассоциации из нескольких типов вирусов с доминированием 16 и/или 18 и 31 типов, а также 18 и 33 типов соответственно. У всех пациентов с самой тяжёлой формой патосперии — олигоастенотератазооспермией — в эякуляте были выявлены несколько представителей ВПЧ с доминированием 16, 31 и 33 типов вируса.

Влияние вируса на морфологические характеристики эякулята характеризовалось негативным воздействием на все его параметры, как на сперматозоиды, так и спермоплазму (рис. 2 и 3).

При анализе результатов электронной микроскопии отмечена фиксация вируса на сперматозоидах у 80,3% пациентов. При этом у большинства пациентов (76,4%) вирус локализовался на акросоме, а в спермоплазме (эпителиальные клетки и др.) был выявлен у 52,9% пациентов.

В сперматозоиде точкой фиксацией вируса в большинстве случаев являлась акросома, при этом поражалась постакросомная пластина (рис. 4).

Кроме того, при поражении акросомиальной пластины отмечалось нарушение её целостности и расширение субакросомального пространства, что нарушало пенетрационную способность сперматозоида (рис. 5 и 6).

У 0,8% обследованных была выявлена также патология хроматина: наличие неконденсированного — у 29,4% пациентов, и разрушенного хроматина — у 31,4% пациентов. Кроме того, у 33,3% пациентов имело место сочетание данных состояний хроматина (рис. 7).

Обсуждение

Доказано, что ВПЧ оказывает негативное влияние на репродуктивное здоровье как женщин, так и мужчин. Влияние ВПЧ на женскую фертильность тщательно изучено и доказано, тогда как влияние на мужской репродуктивный потенциал широко обсуждается в настоящее время. Исследования M. Moghimi еt al. (2019) и L.L. Duan et. al. (2023) предполагают, что ВПЧ может влиять на различные параметры эякулята и приводить к нарушениям других патологических звеньев мужской инфертильности [4][17]. Инфицирование вирусом, особенно высокого онкогенного риска, приводит к качественным и количественным изменениям эякулята, нарушению фертильности пары с усилением апоптоза бластоцисты и уменьшению имплантациив эндометрий-трофобластических клеток, а также порокам развития зародышей и плодов с увеличением числа самопроизвольных преждевременных родов. Тем не менее механизм, с помощью которого происходит запуск звеньев негативных реакций, приводящих к патоспермии, остаётся не до конца изученным.

Важным результатом данного исследования является применение метода электронной микроскопии, позволяющего выявить точки приложения ВПЧ в эякуляте. Доказано, что вирус в большинстве случаев фиксировался на акросоме, нарушая функциональную активность сперматозоида. При этом в большинстве случаев регистрировалась патология постакросомной пластины хроматина. Известно, что постакросомная пластина является одним из определяющих факторов пенетрационной способности сперматозоидов, что может быть выявлено только при электронной микроскопии. У большинства пациентов было отмечено снижение целостности постакросомной пластины и расширение субакросомального пространства (рис. 8).

Кроме того, патология хроматина, которая была выявлена электронной микроскопией, также является одним из определяющих факторов как инфертильности, так и нежелательных явлений после зачатия, среди которых наиболее часто регистрировали самопроизвольный аборт.

Выявленные нами изменения в эякуляте при помощи электронной микроскопии являются определяющими при планировании беременности, а также проведении вспомогательных технологий при инфертильности.

Заключение

По данным трансмиссионной электронной микроскопии эякулята пациентов с инфертильностью, ассоциированной с ВПЧ, капсиды вируса были обнаружены как на сперматозоидах, так и в спермоплазме. Кроме того, в 100% случаев выявлена различная патология сперматозоида, которая характеризовалась дисфункцией акросомы, аксонемы и ядра. Среди патологии акросомы, наиболее часто регистрировали нарушение целостности постакросомной пластины и расширение субакросомального пространства.

У пациентов с инфертильностью, ассоциированной с ВПЧ, наличие капсидов вируса в эякуляте в сочетании с морфопатологическими изменениями в сперматозоиде обосновывает включение в протокол лечения противовирусной терапии.