Фармакологическая и хирургическая экспериментальные модели индукции нарушения сперматогенеза

Введение

Азооспермией называют состояние, при котором сперматозоиды отсутствуют в эякуляте, в том числе после центрифугирования последнего [1]. При анализе статистических данных доля диагностированной азооспермии среди общей популяции мужчин составляет около 1%, а среди мужчин с верифицированным бесплодием — в среднем 10 – 15% [2][3].

Для изучения тех или иных методов лечения мужского бесплодия используют некоторые экспериментальные модели на лабораторных животных. Наиболее популярными являются фармакологические и хирургические (физические) методы.

Среди хирургических моделей наибольшую популярность получили воздействие высокой температурой на яички [2][4–6] и перекрут яичек с последующей деторсией или без неё [7][8]. Другим вариантом хирургической модели является временное (на срок от нескольких часов до суток) наложение лигатур на семенные канатики. Ведущими повреждающими факторами в указанных выше моделях являются ишемия и последующая реперфузия тканей, которые воздействуют на сперматогенный эпителий как напрямую, так и опосредованно, вызывая гибель клеток Leydig и снижение продукции тестостерона. Перекрут яичек и лигирование семенных канатиков без последующей деторсии или снятии лигатуры, соответственно, осложняются ишемическим некрозом тестикулярной ткани, что приводит к полной утрате чувствительности моделей к исследуемой терапии [9][10].

Среди препаратов, которые используются для индукции нарушений сперматогенеза, в том числе необструктивной формы азооспермии (НОА), чаще всего применяются цитостатики цисплатин [11–14] и бусульфан [15–18].

Данные препараты способствуют алкилированию и образованию поперечных сшивок между нитями ДНК, тем самым подавляя деление, рост клеток различного происхождения, в том числе клеток сперматогенного эпителия. Одним из широко используемых веществ является цисплатин (HUANG, POGACH, and NATHAN 1990), представляющий собой комплексное соединение платины, механизм действия которого основан на индукции нерепарируемых повреждении ДНК клеток, приводящих к их апоптотической гибели.

Цель исследования. Провести сравнительное исследование эффективности двух наиболее применяемых экспериментальных моделей по индукции нарушения сперматогенеза на самцах крыс — фармакологической, с использованием цисплатина, и хирургической, с временным наложением лигатуры на семенные канатики.

Материалы и методы

Исследование проводилось в Испытательном центре «Виварно-экспериментальный комплекс» ООО НИИ Митоинженерии МГУ (ИЦ ВЭК) в период с 2017 года по 2019 год. Исследование одобрено локальным этическим комитетом МГУ, протокол № 109 от 10.04.2017 года. В экспериментальное исследование были включены 73 половозрелые особи самцов крыс стока Wistar с массой тела от 250 до 300 г. На протяжении всего исследования крысы были размещены в барьерной зоне ИЦ ВЭК.

Хирургическая индукция нарушения сперматогенеза. В группу с хирургическим методом нарушения сперматогенеза было включено 27 крыс, которых распределили на 3 равноценные группы по 9 особей. Время наложения лигатуры на семенной канатик составляло 12, 24, 36 часов. Для наркоза животных был выбран комбинированный метод — внутрибрюшинное (в/б) введение 15 – 20 мг/кг тилетамина и 15 – 20 мг/кг золазепама (Zoletil Ò, «Virbac S.A.», Carros, France) и 3 – 6 мг/кг ксилазина (XylaVETÒ, «Pharmamagist Gyogyszeripari Kft.», Budapest, Hungary). Хирургический доступ к семенным канатикам и семенникам осуществляли путём разреза всех слоёв яичка по вентральной поверхности и семенного канатика после предварительной хирургической обработки. Непосредственно наложение лигатуры (шёлк, 4-0) выполнялось на семенной канатик дистально с последующим послойным ушиванием раны (Vicryl, 4-0). По истечении 12, 24, 36 часов после операции крыс повторно наркотизировали и осуществляли доступ к гонадам подобно методу, описанному выше, и удаляли наложенные лигатуры, с последующим послойным ушиванием раны (Vicryl, 4-0).

Фармакологическая индукция нарушения сперматогенеза. Для фармакологической индукции нарушений сперматогенеза у крыс использовали курсовое введение цитостатического препарата цисплатина (Cisplatin-TevaÒ, «Teva Pharmaceutical Industries Ltd.», Petach Tikva, Israel) в виде раствора с использованием фосфатно-солевого буферного раствора. Цисплатин вводили в/б 1 раз в сутки на протяжении 5 дней. В самом начале эксперимента использовалась доза 5 мг/кг (n = 9). Данная доза цитостатика приводила к гибели крыс, вследствие чего было принято решение использовать препарат повторно в дозе 5 мг/кг, а также 3 мг/кг (n = 10) и 1 мг/кг (n = 9) 1 раз в сутки на протяжении 5 дней. 100%-ного выживания удалось достичь лишь при использовании цисплатина в дозе 1 мг/кг пятикратно.

Для оценки эффективности фармакологической и хирургической моделей на 0, 7, 14, 28 дня после последнего дня индукции нарушения сперматогенеза выполняли исследование (в каждую временную точку брали по 3 животных): эпидидимальной спермы, клинического анализа крови, уровня общего тестостерона крови, патоморфологическое исследование ткани семенников, массы тела, массы органов репродуктивной системы.

Исследование образцов эпидидимальной спермы. Сперму животных получали путём пункции хвоста эпидидимиса крыс после наркотизации. Сперматозоиды выделяли путем использования фосфатного солевого раствора. Оцениваемые показатели спермы — количество сперматозоидов на гемоцитометре Hemalite 1280 (ООО «Dixion», Москва, Россия), морфология с помощью микроскопа AxioScope A1 («Carl Zeiss AG», Oberkochen, Germany), анализ подвижности сперматозоидов при помощи микроскопа ECLIPSE Ti-E («Nikon Сorp.», «Mitsubishi Group», Tokyo, Japan).

Оценка гематологических показателей. Кровь животных исследовалась на анализаторе Hemalite 1280 (ООО «Dixion», Москва, Россия).

Патоморфологическое исследование ткани семенников. Образцы ткани семенников дегидрировали в изопропаноле с последующей заливкой в парафине. Полученные блоки готовили толщиной 4 – 5 мкм подвергали депарафинированию и регидратированию, окрашиванию гематоксилином-эозином. Оцениваемые параметры с помощью микроскопа AxioScope A1:

1. Занимаемая абсолютная (мм²) и относительная (%) площадь семенных канальцев.
2. Средний диаметр канальцев (мкм).
3. Степень атрофии герминативного эпителия (баллы).
4. Степень воспалительной инфильтрации и фиброза (баллы).
5. Другие морфологические изменения (качественно).

Оценка концентрации общего тестостерона крови. Уровень общего тестостерона крови определяли с помощью иммуноферментного анализа, использовались готовые наборы реактивов (DRG, США).

Статистический анализ. Для выполнения анализа данных использовали метод двухфакторного дисперсионного анализа (факторы группа и время), программное обеспечение — GraphPad Prism 6 by Dotmatics («GraphPad Software» Inc., Graphpad Holdings LLC, San Diego, CA, USA). Параметры описательной статистики: среднее (M), стандартное отклонение (SD), стандартную ошибку среднего (SE). Попарные сравнения групп проводили с использованием критериев Šídák или Tukey HSD. Различия считали значимыми при р < 0,05.

Результаты

Хирургическая модель индукции нарушения сперматогенеза. Хирургическая индукции патоспермии путём наложения лигатур на семенные канатики в целом не оказывали отрицательного влияния на общее состояние животных. Стоит отметить, что в течение 5 дней несколько снизилась масса тела, но к 14-му дню после операции масса тела крыс была выше, чем до операции (р < 0,0001). Также зафиксирован выраженный отёк мошонки.

Показатели клинического анализа крови статистически значимо не отличались от таковых на всех трёх временных точках исследования (р < 0,05).

При анализе динамики массы органов репродуктивной системы выявлено, что снижается средняя масса семенников (р < 0,05), придатка семенника (р < 0,05), предстательной железы (р < 0,05), особенно изменения выражены в группе с 24-часовым наложением лигатуры (р < 0,05). Масса семенных пузырьков не изменилась в группах (р > 0,05) (рис. 1).

Количество эпидидимальных сперматозоидов снизилось во всех группах, однако статистически значимые изменения зафиксированы на 7-й (экспозиция — 24 часа) и 28-й (экспозиция 12 и 36 часов) дни исследования.

Патомофрологическая картина сперматогенного эпителия не продемонстрировала выраженных признаков угнетения сперматогенеза. Исключительно площадь канальцев уменьшилась на 7-й и 28-й дни после операции (экспозиция лигатуры — 24 и 36 часов). Дезорганизация сперматогенного эпителия наблюдалась лишь у единичных крыс в группе с 24-часовым наложением лигатуры (рис. 2).

Фармакологическая модель индукции нарушения сперматогенеза. Как уже упоминалось выше, цисплатиновая модель нарушения сперматогенеза приводила к 100%-ной летальности в дозе цитостатика 5 мг/кг. Для титрования необходимой дозы цисплатина в исследование дополнительно было включено 10 крыс (3 мг/кг) и 9 крыс (1 мг/кг). Цисплатин в  режиме введения 1 мг/кг в/б ежедневно в течение 5 дней позволил обеспечить 100%-ную выживаемость животных.

Масса тела крыс прогрессивно снижалась на всём протяжении исследования без признаков восстановления. Через 1 неделю после индукции нарушения сперматогенеза зафиксированы значимая тромбоцитопения и лейкоцитопения, уровень гемоглобина и эритроцитов снизились незначимо. Уже ко 2-й неделе гематологические показатели приблизились к результатам в контрольной группе (рис. 3).

Масса семенных пузырьков (р = 0,0003), семенников (р = 0,0275), придатков семенников (р = 0,1128), простаты (р = 0,0060) снизились к 4-й неделе после последнего введения цисплатина.

Концентрация сперматозоидов статистически значимо снизилась лишь к 1-й неделе после индукции патоспермии, к 28-й неделе показатель не отличался от контрольной группы. Анализ гистологического исследования ткани семенников продемонстрировал уменьшение абсолютной площади и диаметра семенных канальцев (р = 0,1166 и р = 0,0730 соответственно). Через 2 и 4 недели обнаружена выраженная дезорганизация сперматогенного эпителия (рис. 4).

Обсуждение

Можно сделать вывод, что хирургическая модель с наложением лигатуры на семенные канатики на 12, 24 и 36 часов не продемонстрировала значимого отрицательного воздействия на сперматогенный эпителий. Несмотря на существующие публикации, где применялась бы хирургическая модель [19–21], как результат, необструктивная форма азооспермии не фиксируется, возникают другие количественные и качественные изменения показателей спермограммы, однако они самостоятельно обратимы.

Стоит отметить, что более длительное время экспозиции лигатуры не оказывало большего эффекта в сравнении с 12 часами. К тому же хирургическая модель сопровождается большим объёмом работы, необходимостью операции и ре-операции с наркозом, что может повлечь за собой гибель исследуемых животных. Также важно, что наложение лигатуры или метод с перекрутом яичка ограничивают кровоток по сосудам семенного канатика, что может привести к некрозу гонад. При наложении лигатур на семенные канатики может возникать значительное повреждение (разрыв, перетирание) семявыносящего протока, приводя тем самым к обструктивной форме азооспермии. Вышеуказанные нежелательные исходы модели превращают повреждения в необратимые. С последними заключениями согласны и ряд авторов [19–21].

В фармакологической, цисплатиновой модели выявлено значимое снижение массы репродуктивных органов и ухудшение гистологической картины семенников без признаков обратимости состояния. Отмечается высокая токсичность препарата, так как выраженно снижается и масса тела крыс, что может также спровоцировать отрицательные изменения сперматогенного эпителия отсрочено, помимо кумулятивного действия цисплатина. К данным заключениям приходит также ряд авторов, но есть некоторые отличия [11–14].

В частности, авторы рекомендуют использовать цисплатин в дозе 2 мг/кг и 2,5 мг/кг, что позволяет добиться дожития животных [11][13].

J. G. Harman et al. (2014) [13] в своём исследовании продемонстрировали, что использование цисплатина в дозе 5 мг/кг/день приводит к гибели крыс, а использование 2,5 мг/кг/день однократно или дважды позволяет добиться значимых нарушений сперматогенеза без смерти лабораторных животных [13].

R. Abdel-Latif et al. (2022) [11], напротив, не отметили гибели крыс (используемая доза цисплатина составила 7 мг/кг), но цитостатик статистически значимо ухудшил все показатели спермы и гистологическую картину биоптатов семенников. Однако отличием протокола является однократная инъекция цисплатина [11].

Заключение

В результате проведённого эксперимента и межгруппового анализа хирургическая модель является нерепрезентативной. Наложение лигатуры на семенной канатик с разной продолжительностью не вызывала стойкого, необходимого угнетения сперматогенеза (азооспермию) у крыс, что полностью бы не исключало спонтанного восстановления, регенерации сперматогенного эпителия. Среди других отрицательных сторон можно отметить необходимые временные и технические факторы, факт повторной операции. А в некоторых ситуациях может произойти повреждение сосудов семенного канатика и семявыносящего протока, приводящее к непригодности модели, без признаков чувствительности используемых методов терапии. В нашем исследовании цисплатин продемонстрировал выраженное угнетение сперматогенеза, значимое токсическое действие на самих крыс. Однако сопоставление с существующими доклиническими работами цисплатиновая модель репрезентативна показывает, что следует использовать дозы менее 2,5 мг/кг, а кратность введения — менее 5.