Роль экспрессии переносчика глюкозы первого типа (GLUT1) и карбоновой ангидразы 9 типа (CAIX) тканью аденокарциномы простаты в определении прогноза заболевания и эффективности радикального лечения

Введение

Известно, что для определения прогноза течения рака предстательной железы на сегодняшний день используются такие показатели, как уровень простат-специфического антигена (ПСА), стадия заболевания, а также степень дифференцировки опухолевых клеток при морфологическом исследовании. Однако, несмотря на обширный арсенал современных диагностических методов, в мире сохраняется значительное число случаев как гипердиагностики и лечения клинически незначимых форм заболевания, так и позднего выявления высокозлокачественных и прогностически неблагоприятных форм рака простаты, что указывает на необходимость поиска дополнительных маркеров для оценки прогноза заболевания и эффективности лечения [1][2].

Для многих злокачественных опухолей характерно повышение интенсивности поглощения глюкозы по сравнению со здоровыми тканями, а также активный рост и развитие в условиях гипоксии. Рак простаты не является исключением. Имеются данные о связи между высоким уровнем гипоксии в ткани опухоли с развитием кастрационной рефрактерности и снижением эффективности гормональной терапии аденокарциномы простаты [3], а также между повышенным уровнем потребления глюкозы опухолевыми тканями вследствие высокого уровня экспрессии переносчика глюкозы первого типа (GLUT1) с активным метастазированием опухоли, поражением лимфатических узлов, объемом опухоли и прогрессированием заболевания [4]. Таким образом, перспективным направлением определения прогноза заболевания может стать оценка экспрессии таких маркеров как CAIX, отвечающего за поддержание нормального уровня pH в клетке в условиях гипоксии и GLUT1, отвечающего за транспорт глюкозы через цитоплазматическую мембрану клетки.

В нашем исследовании была проведена оценка уровня экспрессии CAIX и GLUT1 в ткани аденокарциномы простаты различной степени злокачественности, а также последующее определение её роли в прогнозировании течения заболевания и онкологической эффективности проведенной радикальной простатэктомии.

Цель исследования: определить степени экспрессии CAIX и GLUT1 клетками аденокарциномы простаты различной степени злокачественности для оценки прогноза заболевания и эффективности радикальной простатэктомии.

Материалы и методы

В период с июня 2015 года по март 2017 года было проанализировано 100 образцов архивного послеоперационного материала пациентов после радикальной простатэктомии по поводу рака предстательной железы, проведённой в клинике Института урологии и репродуктивного здоровья человека Сеченовского Университета с морфологически подтверждённой аденокарциномой простаты. Анализ проводили на базе Централизованного патологоанатомического отделения Сеченовского Университета. Проведена оценка таких параметров как возраст, объём простаты, балл International Society of Urological Pathology (ISUP) (балл по Gleason определяли по шкале в модификации J. Epstein  et al. (2016)), уровень ПСА, факт наличия биохимического рецидива (повышение ПСА > 0,2 нг/мл) в течение 2 лет, распространение опухоли за пределы капсулы железы, а также наличие положительного хирургического края. Клинические данные приведены в таблице.

В ходе иммуногистохимического исследования были использованы следующие антитела: кроличьи моноклональные антитела GLUT1, AC-0132A (Epitomics, Inc., Burlinggame, CA, USA), кроличьи моноклональные антитела Carbonic Anhydrase IX (CAIX), 379R-14 RUO Cell Marque ™ («Sigma Aldrich» Corp., Saint-Lewis, MO, USA).

Исследование осуществляли по стандартному протоколу. Проводили фиксацию ткани в забуференном формалине с последующей заливкой в парафин. Срезы толщиной 5 мкм помещали на поли-L-лизиновые стекла, депарафинизировали, регидрировали. Эндогенная пероксидаза блокировалась 3% раствором перекиси водорода в течение 10 минут. Затем для проведения ИГХ-реакции на срезы наносили 50 мкл разведённой первичной сыворотки с последующей инкубацией в течение 30 минут при 37 °C. При достижении удовлетворительной степени окрашивания срезы отмывали дистиллированной водой и окрашивали гематоксилином Meyer в течение 3 минут.

Интенсивность экспрессии GLUT1 и CAIX оценивали в эпителии опухоли два патоморфолога независимо друг от друга. При несовпадении оценки третий приглашённый специалист формировал окончательное решение. Интенсивность экспрессии выражали в баллах, где 0 баллов — её отсутствие, 1 балл — экспрессия в < 20% клеток, 2 балла — 20 – 40% клеток, 3 балла — > 40% клеток.

Статистический анализ. Обработку данных проводили в программе IBMÒ SPSS Statistics 20.0 («SPSS: An IBM Company», IBM SPSS Corp., Armonk, NY, USA). Данные проверены на нормальность распределения с помощью тестов Shapiro-Wilk и Колмогорова-Смирнова. Статистически значимым считали уровень p < 0,05 при а = 0,05.

Результаты

В ходе иммуногистохимического исследования экспрессия маркеров CAIX и GLUT1 выражалась в виде окрашивания цитоплазматической мембраны клеток опухоли. Иммуноэкспрессия GLUT1 отсутствовала лишь в одном образце опухоли. В 58,0% образцов наблюдалась экспрессия в < 20,0% клеток, в 40,0% образцов — экспрессия 20,0 – 40,0% клеток. При подсчёте корреляции Spearman степень экспрессии GLUT1 статистически значимо прямо коррелировала со степенью злокачественности ISUP 4 и 5 (r = 0,457, p < 0,0001) (рис. 1В), уровнем ПСА (r = 0,378, p < 0,0001), стадией заболевания pT3b (r = 0,380, p < 0,0001), экстракапсулярным распространением опухоли (r = 0,355, p = 0,001), а также обратно коррелировала со степенью злокачественности ISUP1 (r = -0,274, p = 0,009) (рис. 1А) и стадией заболевания pT2c (r = -0,423, p < 0,0001). Иммуноэкспрессия CAIX наблюдалась лишь в 10,0% образцов и обладала низкой выраженностью (< 20,0% клеток). Единственной статистически значимой корреляцией, касающейся CAIX, являлась зависимость между наличием её экспрессии в опухолевых клетках и уровнем экспрессии GLUT1 (r = 0,331, p = 0,01) (рис. 2).

Обсуждение

Особенность метаболизма здоровых клеток предстательной железы заключается в необычном пути обмена глюкозы — аэробном гликолизе. Несмотря на достаточное снабжение клеток кислородом, цикл трикарбоновых кислот в клетке проходит не полностью, обеспечивая клетку меньшим числом молекул АТФ, чем при окислительном фосфорилировании. Происходит это по причине ингибирования фермента м-аконитазы, взаимодействующего с цитратом, вызванного десятикратным увеличением количества ионов цинка в цитоплазме клетки. Накопленный в клетке цитрат в дальнейшем выделяется в межклеточный матрикс и входит в состав секрета простаты [5][6]. В клетках аденокарциномы простаты на ранних стадиях заболевания основным путём энергетического метаболизма является окислительное фосфорилирование, способность к которому клетки приобретают, восстановив полностью цикл трикарбоновых кислот [7]. Это происходит в связи со снижением активности транспортёров цинка, приводящих к падению его внутриклеточной концентрации [8][9].

Следует обратить внимание, что на ранних стадиях заболевания отмечается сравнительно низкий уровень потребления глюкозы злокачественными клетками. Однако с ростом степени злокачественности по Gleason, а также при наличии гормональной рефрактерности растёт и потребление глюкозы опухолевой тканью [10]. Таким образом, можно предположить, что определение интенсивности поглощения глюкозы клетками аденокарциномы простаты может служить диагностическим маркером прогноза заболевания. Семейство переносчиков глюкозы (GLUTs) обеспечивает энергетически-независимый транспорт глюкозы и других гексоз через цитоплазматическую мембрану клетки по градиенту накопления. В настоящий момент известно о 13 представителях семейства, обладающих различной аффинностью к гексозам, при этом наиболее чувствительны к глюкозе типы GLUT1, GLUT2, GLUT3, GLUT4 [11]. Из всех типов переносчиков глюкозы в ткани простаты наибольшее внимание уделено GLUT1. Результаты исследований, касающихся данного переносчика разнородны, зачастую противоречат друг другу. В одной из первых работ, посвящённых экспрессии переносчиков глюкозы в клетках гиперплазии и рака простаты при ИГХ-исследовании ткани гиперплазии и аденокарциномы простаты было показано, что ткань гиперплазии простаты экспрессирует только GLUT1, тогда как клетки аденокарциномы экспрессируют GLUT1 и GLUT12 [12]. В другом исследовании K. Reinicke  et al. (2012), сравнивая экспрессию вышеописанного маркера в здоровой ткани простаты, гиперплазированной ткани, внутрипротоковом раке простаты, ПИН и аденокарциноме простаты, GLUT1 определялся лишь в первых трёх [13]. В последующих работах отмечали повышение экспрессии GLUT1 как в лабораторных клеточных линиях аденокарциномы простаты (LNCaP, LNCaP-R, PC-3, DU-145), так и в послеоперационном материале гормон-чувствительного и кастрационно-рефрактерного рака простаты [14–19]. Высокая степень экспрессии коррелировала с баллом по Gleason >7 и ПСА >20 нг/мл [14], а также среди пациентов после радикальной простатэктомии, худшей выживаемостью без биохимического рецидива, худшей выживаемостью без кастрационно-рефрактерного рака простаты, худшей выживаемостью без метастазирования [4].

На фоне активных метаболических процессов в ткани аденокарциномы простаты при условии недостаточного снабжения кислородом происходит снижение pH внутри опухолевых клеток, что может негативно влиять на их жизнеспособность, приводя к апоптозу. Существуют механизмы, позволяющие клеткам, в том числе опухолевым, выживать в условиях кислой среды с низким pH, одним из которых является семейство карбоновых ангидраз. Карбоновые ангидразы — это группа цинксодержащих металлоферментов, участвующих в регуляции рН и обратимом преобразовании углекислого газа в бикарбонат и протоны [20]. В ответ на гипоксию они обеспечивают жизнеспособность клетки, поддерживая оптимальный уровень внутриклеточного pH (6,9 – 7,0) [21]. В первом опубликованном исследовании, оценивающем экспрессию CAIX в ткани гиперплазии простаты и рака простаты (со степенью злокачественности по Gleason 3 – 5), значимая иммуноэкспрессия отсутствовала во всех образцах тканей. Авторы предполагали, что, несмотря на наличие зон гипоксии в тканях рака предстательной железы, отсутствие экспрессии CAIX связно с иными механизмами регуляции pH в злокачественных клетках [22]. В работе D. P. Donato  et al. (2011), посвящённой оценке уровня экспрессии CAIX в опухолях мочеполовой системы и образованиях надпочечников, наряду с высоким уровнем экспрессии в новообразованиях, содержащих светлые клетки (почечноклеточная карцинома, уротелиальная карцинома, опухоль клеток Sertoli, светлоклеточная аденокарцинома и кортикальная карцинома), иммуноэкспрессия здоровыми клетками, клетками аденокарциномы простаты, а также мелкоклеточной карциномы простаты полностью отсутствовала [23]. Однако работа T. Fiaschi  et al. (2013) указывала на наличие экспрессии CAIX как клетками рака простаты различных лабораторных линий (LNCaP, DU145, PC-3), так и стромальными клетками опухоли — канцер-ассоциированными фибробластами (CAFs — cancer-associated fibroblasts) [24]. Аналогично в исследовании M. R. Ambrosio  et al. (2016) цитоплазматическая и ядерная экспрессия CAIX наблюдалась в лабораторных линиях рака простаты LNCaP и PC-3, а также в биоптатах простаты, содержащих опухолевые клетки. Экспрессия ассоциировалась с наличием в ткани фактора, индуцированного гипоксией HIF1α, что указывает на то, что CAIX может быть маркером тканевой гипоксии. Уровень экспрессии позитивно коррелировал со стадией и степенью злокачественности рака предстательной железы [25]. При этом таргетное ингибирование CAIX в ткани рака простаты приводило к снижению pH в клетках в условиях гипоксии, что вызывало снижение скорости роста клеток, а также повышение интенсивности апоптоза [26].

Полученные в ходе текущего исследования данные, касающиеся экспрессии GLUT1 в клетках опухоли, соотносятся с данными мировой литературы и свидетельствуют о потенциальной возможности использования его как маркера определения прогноза заболевания. Значимой корреляции между экспрессией CAIX и значимыми клиническими параметрами получено не было, что может свидетельствовать о наличии иных механизмов регуляции pH в клетках аденокарциномы простаты.

Заключение

Повышенная иммуноэкспрессия переносчика глюкозы 1 типа (GLUT1) клетками аденокарциномы простаты у пациентов после радикальной простатэктомии ассоциирована с высокой степенью злокачественности (ISUP 4 и 5), стадией заболевания pT3b, морфологически подтверждённым экстракапсулярным распространением опухоли, а также высокими значениями ПСА, что позволяет использовать её для оценки прогноза течения заболевания.