Роль генетических факторов в развитии рецидивирующего уролитиаза

Введение

За последние три десятилетия число случаев уролитиаза в мире выросло на 48,57%. За этот же период смертность из-за него в мире возросла на 17,12% [1]. На территории Российской Федерации распространённость данного заболевания за 15 лет (2005 – 2019 гг.) во всех регионах стала выше на 16,20% [2].

Уролитиаз — это полиэтиологическое заболевание мочевыделительной системы, при котором наблюдается отложение солей в мочевыводящих путях [3][4]. В основе патогенеза заболевания лежат также генетические факторы [5]. При изучении наследственного фактора близнецовым методом было выявлено, что у пациентов, имеющих факторы риска мочекаменной болезни, наследуемость развития клинических форм заболевания составляет 45 – 50% [6]. В частности, однонуклеотидные полиморфизмы (англ. — Single Nucleotide Polymorphism, SNP) в различных генах могут оказывать влияние на риск развития и рецидива данного заболевания [7]. Раннее установление наследственной предрасположенности к манифестации и рецидиву данного заболевания может оказаться важнейшим звеном в профилактике мочекаменной болезни [8]. Таким образом, изучение роли полиморфизмов в патогенезе уролитиаза является актуальной задачей.

В данной работе в качестве изучаемых генетических факторов были выбраны SNP в генах TNFRS11B (Tumor necrosis factor receptor superfamily member 11B, или остеопротегерин; rs3134057), ESR1 (Estrogen receptor isoform 1; rs851982), VDR (Vitamin D receptor; rs1540339), CASR (Calcium-sensing receptor; rs2202127), KL (Klotho protein; rs526906), белковые продукты которых так или иначе участвуют в поддержании кальциевого гомеостаза или в развитии нефрологических патологий. Так, TNFR-опосредованная (Tumor necrosis factor receptor) сигнализация необходима для адгезии кристаллов оксалата кальция к люминальной мембране почечных канальцев, что является основным инициирующим механизмом оксалатной нефропатии [9], а терапевтическая блокада TNFR сдерживает развитие прогрессирующих форм нефрокальциноза при данном заболевании [10]. У женщин в постменопаузе, принимающих заместительную гормональную терапию эстрогеном, повышен pH мочи и снижено содержание фосфата кальция в ней по сравнению с не принимающими препараты эстрогена после наступления менопаузы [11], что подтверждает роль рецепторов экстрогена в гомеостазе кальция. Белковый продукт гена VDR естественным образом регулирует биологическую активность витамина D — важного регулятора баланса кальция в организме. Так, пациенты, получающие избыточные дозы витамина D, чаще страдают от мочекаменной болезни [12]. Обусловленные CASR физиологические эффекты обширны, среди них замедление реабсорбции ионов кальция в нефроне, увеличение экскреции воды, цитрата, протонов и реабсорбции фосфат-ионов. По данным литературы, наличие полиморфизмов, которые уменьшают плотность расположения CASR на клетках, ассоциировано с более частым развитием нефролитиаза [13]. Белок Klotho образует петлю отрицательной обратной связи с механизмом синтеза кальцитриола — наиболее биологически активной формы витамина D. Мыши, дефицитные по данному белку, характеризовались повышенной концентрацией кальция в плазме крови [12]. Кроме того, KL может напрямую взаимодействовать с неселективными катионными каналами TRPV5 (Transient receptor potential cation channel subfamily V member 5), участвующими в трансцеллюлярной реабсорбции кальция дистальными канальцами нефрона [12].

Цель исследования. Изучить ассоциации SNP rs3134057, rs851982, rs1540339, rs2202127, rs526906 с развитием рецидивирующего уролитиаза.

Материалы и методы

Дизайн исследования. Исследование было одобрено локальным этическим комитетом Медицинского научно-образовательного центра Московского университета им. М.В. Ломоносова (Протокол №12/20 от 21.12.2020 года) и проведено в соответствии с постулатами Хельсинской декларации. Все участвующие пациенты предоставили подписанные формы добровольного информированного согласия. Всего в период с января 2021 года по январь 2022 года в исследование было включено 96 человек; среди них 45 пациентов — с рецидивом мочекаменной болезни, причём с локализацией основного конкремента в одном из мочеточников (основная группа); контрольная группа состояла из 51 добровольца, не страдающего мочекаменной болезнью, семейный анамнез которых также не был отягощён данным заболеванием. Клинические и демографические характеристики участников исследования представлены в таблице 1. Размер камня оценивали с помощью компьютерной томографии органов мочевыводящей системы без контрастирования.

Сбор и обработка биоматериала. Образцы венозной крови собирали в объёме 4,5 мл в вакуумные пробирки («Greiner Bio-One GmbH», Kremsmünster, Аustria, 2016). Интактную кровь аликвотировали в пробирки объёмом 1,5 мл и хранили при температуре -20°С. После размораживания каждый образец крови тщательно перемешивали пульс-вортексированием. ДНК выделяли из 200 мкл интактной крови с помощью набора реагентов QIAamp DNA Blood Mini Kit («Qiagen GmbH», Hilden, Germany, 2006) с использованием роботизированной системы QIACube («Qiagen GmbH», Hilden, Germany, 2016) в соответствии с рекомендациями производителя.

Генотипирование. Анализ однонуклеотидных полиморфизмов в изучаемых генах пациентов основной и контрольной групп проводили с помощью метода ПЦР в режиме реального времени на амплификаторе Real-time CFX96 Touch («Bio-Rad Laboratories, Inc.», Hercules, CA, USA, 2018) со следующими условиями термоциклирования: выдержка при 95°С в течение 10 минут, 40 циклов денатурации при 92°С в течение 15 секунд и отжига / элонгации при 60°С в течение 1 минуты. Информация об изучаемых однонуклеотидных полиморфизмах и использованных для их выявления реактивах представлена в таблице 2.

Методы статистического анализа. Анализ проводили с помощью программного обеспечения SNPstats («Institut Català d'Oncologia», Barcelona, Spain, 2006) и IBM SPSS Statistics 22.0 («IBM Corp.», New York, NY, USA, 2013). Статистической моделью для анализа данных служила биномиальная логистическая регрессия. Статистически значимым различием считалось p < 0,05.

Результаты

Частоты минорных аллелей в контрольной группе соответствовали таковым европейской популяции по данным сервиса «The Single Nucleotide Polymorphism database» [14]: для rs3134057 — 0,30 против 0,39; для rs851982 — 0,38 против 0,38; для rs1540339 — 0,46 против 0,36; для rs2202127 — 0,35 против 0,33; для rs526906 — 0,15 против 0,17, соответственно.

В результате статистического анализа была обнаружена ассоциация между наличием SNP rs3134057 в гене TNFRS11B (отношение шансов (ОШ) — 1,92; доверительный интервал (ДИ): 1,05 – 3,52; p = 0,031) и развитием рецидивирующего уролитиаза, в то время как подобной статистически значимой ассоциации не обнаружилось для остальных исследуемых SNP в генах ESR1, CASR, VDR и KL (rs851982, rs2202127, rs1540339, rs526906 соответственно) (p > 0,05) (табл. 3, рис.).

Для поиска ассоциации комбинаций вышеперечисленных SNP с развитием рецидивирующего уролитиаза был проведён анализ неравновесного сцепления аллелей, который показал отсутствие статистически значимого взаимодействия между исследуемыми SNP (p > 0,05). Субанализ комбинаций гаплотипов для 2 – 5 SNP также не выявил ни одной статистически значимой комбинации (p > 0,05).

Обсуждение

Все исследуемые SNP являются интронными. По данным сервиса Haploview [15] изучаемые нами полиморфизмы находятся в регионах с выраженным неравновесным сцеплением аллелей соответствующих им генов и могут быть ассоциированы со степенью экспрессии последних.

Для части исследуемых SNP известны их прямые эффекты на метаболизм и физиологические процессы в клеточных линиях и многоклеточных организмах. Так, внедрение минорного аллеля rs851982 ESR1 приводит к повышению активности промотора генов ESR1 и RMND1 (Required for Meiotic Nuclear Division protein 1) в клеточных линиях ER⁺ MCF-7, BT-474 и ER⁺MCF-7, BT-474, ER⁻Bre-80, соответственно (Estrogen receptor «+» Michigan Cancer Foundation-7; Breast tumor 474; Estrogen receptor «–» breast-80); иммунопреципитация хроматина показала, что ген с rs8519882 обогащен GATA3 (GATA binding protein 3), но плотность посадки GATA3 не различается между клетками с SNP и нормальным аллелем [16]. Кроме того, наличие SNP rs851982 статистически значимо связано с более высокой минеральной плотностью шейки бедренной кости (p = 0,012) [17]. Несмотря на указанные данные, мы не обнаружили связи между rs851982 и развитием рецидивирующего уролитиаза, что согласуется с данными отечественных учёных [18].

Наличие минорного аллеля rs1540339 гена VDR (как в гетерозиготном варианте, так и в гомозиготном: ОШ = 0,55; 95% ДИ: 0,35 – 0,88; p = 0,01 и ОШ = 0,404; 95% ДИ: 0,20 – 0,78; p = 0,005 соответственно) снижает восприимчивость к туберкулёзу. Кроме того, у больных туберкулёзом отмечается существенно меньшее количество мРНК VDR. Оба этих факта могут свидетельствовать о влиянии rs1540339 на экспрессию гена VDR. Важно отметить, что VDR играет ключевую роль в развитии иммунного ответа на инфекцию, запуская сборку фаголизосомального комплекса после связывания с активной формой витамина D [19]. Впрочем, данные о роли rs1540339 в развитии уролитиаза противоречивы, поскольку есть работы, как подтверждающие [20], так и опровергающие его роль [21]. В нашем исследовании подобной связи также не было обнаружено, и, возможно, требуется дальнейшее изучение влияния rs1540339 на предрасположенность пациента к уролитиазу.

На данный момент для SNP rs2202127 в гене CASR нет данных in vivo и in vitro исследований, демонстрирующих изменение экспрессии при наличии минорного аллеля. Вместе с тем известно, что наличие rs2202127 связано c повышенным уровнем сывороточного кальция [22], что может косвенно подтверждать его роль в метаболизме кальция.

О.И. Аполихин и соавт. (2016) обнаружили ассоциацию рецидивирующего уролитиаза с полиморфизмом rs2202127 в гене CASR [18], однако в ходе последующих исследований и в ходе нашего исследования эти данные не подтвердились [20]. Таким образом, существующие данные о влиянии rs2202127 на рецидивирующий уролитиаз противоречивы, что указывает на необходимость проведения более крупных исследований с выделением дополнительных подгрупп пациентов.

В нашем и аналогичных исследованиях не удалось обнаружить ассоциацию SNP rs526906 в гене KL с развитием уролитиаза [19][22], хотя и было показано, что наличие полиморфизма в гене KL приводит к увеличению экспрессии последнего [23].

На данный момент нет данных in vivo и in vitro исследований об изменении экспрессии гена TNFRS11B при наличии SNP rs526906; вместе с тем была установлена связь данного полиморфизма с пониженной массой дистальной части лучевой кости [24]. Мы обнаружили, что наличие полиморфизма TNFRS11B связано с развитием уролитиаза, в то время как в исследовании О.И. Аполихина и соавт. (2016) обозначенной ассоциации не было найдено [18], что может объясняться различиями в условиях включения: в наше исследование были включены лишь пациенты с рецидивирующей формой уролитиаза, а также локализацией конкремента в мочеточнике.

Помимо SNP, которые были исследованы в данной работе, существуют и другие перспективные полиморфизмы для изучения генетических предикторов развития уролитиаза. Например, имеются данные о статистически значимой связи полиморфизма гена ORAI1 (Calcium release-activated calcium modulator 1) (rs7135617) с риском образования камней оксалата кальция [20]. ORAI1 является субъединицей мембранного кальциевого канала, которая активируется, когда запасы кальция истощаются. Y.H. Chou et al. (2011) выявили два SNP данного гена, rs12313273 и rs6486795, повышающие риск развития кальциевого нефролитиаза [25].

Ограничения исследования. Ограничением данного исследования может служить малая численность выборки пациентов.

Заключение

Изучение генетических предикторов развития уролитиаза является важным и перспективным научным направлением в контексте тенденций к более персонализированному подходу в современной медицине. Знание о генетической предрасположенности к заболеванию у конкретного пациента, возможно, позволит своевременно принять превентивные меры, обратить внимание на модифицируемые факторы риска, что впоследствии может существенно повысить его качество жизни, а также улучшить экономические показатели в сфере здравоохранения.

В связи с обнаружением ассоциации между наличием SNP rs3134057 в гене TNFRS11B с развитием рецидивирующего уролитиаза актуальной задачей является изучение влияния этого SNP на уровень сывороточного остеопротегерина — продукта гена TNFRS11B.

Ключевые моменты:

1. Остеопротегерин играет важную роль в патогенезе рецидивирующего уролитиаза, следовательно, мониторинг его уровня в различном биоматериале может представлять практический интерес.
2. Наличие минорного аллеля SNP rs3134057 в гене TNFRS11B значимо ассоциировано с развитием рецидивирующего уролитиаза, генотипирование по этому полиморфизму может быть применено в рамках оценки генетической предрасположенности к данному заболеванию.
3. Расположение SNP rs3134057 в интроне гена TNFRS11B указывает на его влияние на непосредственную экспрессию остеопротегерина, а не на его структуру. Таким образом, в будущих исследованиях по изучению уровня остеопротегерина при рецидивирующем уролитиазе для повышения диагностической точности рекомендуется установление индивидуальных пороговых значений для каждого из генотипов по SNP