Влияет ли ботулинотерапия на микробиом мочи больных нейрогенным мочевым пузырём? Результаты метагеномного секвенирования

Введение

Длительное время считалось, что моча здорового человека стерильна. Однако за последнее десятилетие представления о микрофлоре мочевыводящих путей кардинально изменились. В 2010 году D.E. Nelson et al. [1] с помощью секвенирования 16S рРНК обнаружили бактерии в моче здоровых мужчин, а М.И. Коган и соавт. (2010), использовав культуральное исследование с расширенным набором сред, показали, что моча здоровых женщин также не стерильна [2]. H. Siddiqui et al. в 2011 году подтвердили эти данные путём метагеномного секвенирования [3]. В дальнейшем рядом учёных был исследован микробиом мочи в норме [4][5][6][7][8][9][10] и при некоторых заболеваниях: гиперактивном мочевом пузыре [10][11], недержании мочи [12], хроническом простатите [13], интерстициальном цистите [14][15], раке мочевого пузыря [16][17], раке предстательной железы [13], мочекаменной болезни [19] и других.

Новые знания о микрофлоре мочи побудили урологов изменить взгляд на бессимптомную бактериурию и вопросы профилактики инфекций мочевыводящих путей (ИМП) [20].

Рецидивирующие ИМП являются одной из ведущих проблем в лечении больных нейрогенным мочевым пузырём. Каждый пациент с НДНМП переносит около 2,5 эпизодов ИМП в год [21], что обусловливает прогрессирование хронической почечной недостаточности [22] и может приводить к серьёзным септическим осложнениям, вплоть до летального исхода [23]. Профилактика ИМП у больных нейрогенным мочевым пузырём основывается, в первую очередь, на коррекции уродинамических нарушении, борьбе с детрузорной гиперактивностью, пузырно-мочеточниковым рефлюксом, правильном выборе способа отведения мочи [24].

Изменения, характерные для микробиома пациентов с нейрогенной дисфункцией мочевыводящих путей (НДНМП), были продемонстрированы D.E. Fouts et al. [5] в 2012 году и S.l. Groah et al. [9] в 2016 году с помощью секвенирования 16S рРНК. В литературе отсутствуют данные о том, как меняется микробиом мочи больных НДНМП на фоне различных видов лечения, в частности, детрузоростабилизирующей терапии.

Цель исследования: проанализировать микробиом мочи больных НДНМП при проведении ботулинотерапии.

Материалы и методы

В исследовании участвовали шесть больных НДМП, страдающих частыми рецидивами ИМП. Характеристика пациентов представлена в таблице 1.

Все пациенты дважды прошли обследование, включавшее общеклинические анализы, бактериологическое исследование мочи, ультразвуковое исследование мочевыделительной системы, а также комплексное уродинамическое исследование (КУДИ) до введения ботулотоксина и через 6 недель после.

В момент забора образцов мочи для исследования никто из пациентов не имел клинических симптомов ИМП. Также пациенты были предупреждены о том, что не должны принимать антибактериальные препараты в течение не менее, чем двух недель, до сдачи анализа.

В госпитальных условиях пациентам были выполнены внутридетрузорные инъекции ботулотоксина. В операционной под внутривенной анестезией пациентам выполняли уретроцистоскопию, после чего, при наполнении мочевого пузыря до 200 мл по манипуляционному каналу уретроцистоскопа проводили эндоскопическую иглу, через которую вводили в стенку мочевого пузыря внутридетрузорно 200 ЕД онаботулотоксина типа А (Ботокс, Аллерган) в 20 точках (10 ЕД/ точка) на глубину 2 - 3 - 5 мм в зависимости от толщины его стенки.

Забор образцов мочи для метагеномного секвенирования выполняли с письменного согласия пациентов до процедуры ботулинотерапии и через 6 недель после неё. Мочу в стерильный контейнер забирал врач путём катетеризации мочевого пузыря одноразовым лубрицированным катетером. Образцы мочи подвергали немедленной заморозке и хранили при температуре -25^ос. с соблюдением температурного режима образцы транспортировали в лабораторию.

Выделение и контроль качества ДНК. Выделение ДНК было проведено протоколом с использованием силикатных колонок из 12 образцов. Контроль качества полученной ДНК был проведён с помощью электрофореза в агарозном геле (рис. 1 - 2).

Рисунок 1. Электрофорез ДНК, содержащейся в моче (образцы 1 ‒ 8)
Figure 1. Electrophoresis of the DNA contained in the urine (samples 1 ‒ 8)

Рисунок 2. Электрофорез ДНК, содержащейся в моче(образцы 9 ‒ 12)
Figure 2. Electrophoresis of the DNA contained in the urine (samples 9 ‒ 12)

Для оценки бактериальных геномов и контроля отсутствия ПЦР-ингибиторов была проведена количественная ПЦР с праймерами на вариабельный регион V3 - V4 16S рРНК на приборе Step One Plus (Applied Biosystems).

Подготовка библиотек фрагментов ДНК. Из входящего биоматериала были приготовлены библиотеки ДНК для секвенирования вариабельных регионов V3 - V4 гена 16S рРНК согласно протоколу Illumina [25]. Контроль качества библиотек проведен на приборе Labchip GX Touch 24.

Секвенирование ДНК. Образцы были разведены и секвенированы в соответствии с протоколами Illumina [25]. Исходные данные были получены в формате FASTQ, 250 PE. Для каждого образца получено более 10 000 пар прочтений.

Полученные прочтения были обработаны при помощи следующих программ:

• cutadapt1 v2.7 — удаление адаптерных последовательностей и нуклеотидов с низким качеством прочтения;
• FLASH2 v2 - объединение парноконцевых прочтений в цельные последовательности;
• UCHIME3 v2 — удаление химерных последовательностей в соответствии с базой данных Greengenes;
• RDPTools4 v11 — классификация прочтений в соответствии с базой данных RDP5 v11.5.

Контроль качества прочтений. У исходных прочтений были удалены адаптерные последовательности и нуклеотиды с низким качеством прочтения при помощи инструмента cutadaptl v2.7. В результате доля нуклеотидов с качеством прочтения не менее 30 (phred ≥30) составляет 90 - 95% в каждом образце. Парноконцевые прочтения были объединены в цельные последовательности вариабельных регионов V3 - V4 гена 16S рРНК при помощи инструмента FLASH2 v1.2 (рис. 3). Медианная доля прочтений, объединённых в цельные последовательности, составляет 96%.

Рисунок 3. Схема объединения парноконцевых прочтений в цельные последовательности при помощи инструмента FLASH
Figure 3. Scheme of paired-end reads adjustment using FLASH tool

Химерные последовательности были удалены при помощи инструмента UCHIME3 v4.2. В качестве референса использовали выравнивание последовательностей из базы данных Greengenes, предоставленные ресурсом Broad Institute [26]. В среднем в образцах содержалось 1,4% химерных последовательностей.

В результате для каждого образца было получено более 9 500 пар прочтений хорошего качества (в среднем 12 000 пар прочтений), среди которых отсутствовали химеры.

Прочтения хорошего качества, среди которых отсутствуют химеры, были классифицированы при помощи инструмента RDPTools v2.11. Классификацию прочтений проводили в соответствии с базой данных RDP v11.5, с порогом сходства 90%.

В среднем 94% прочтений в каждом образце было классифицировано до семейства и 85% прочтений в каждом образце было классифицировано до рода.

Статистическую обработку данных осуществляли с помощью программного пакета SPSS 23.0 for Windows. Данные представлены в виде m ± SD, где m — среднее значение, SD — стандартное отклонение. Для оценки достоверности различий средних использовался U-критерий Манна-Уитн. Различия считали достоверными при p <0,05.

Результаты

Все пациенты, участвовавшие в исследовании, имели клиническое и уродинамическое улучшение на фоне лечения (табл. 2). Цистометрическая ёмкость мочевого пузыря увеличилась в среднем, на 187,3 ± 79,51 мл. Объём мочевого пузыря, при котором возникало первое непроизвольное сокращение детрузора (эпизод гиперактивности) на 285,5 ± 94,8 мл, максимальное давление детрузора в момент непроизвольного сокращения снизилось на 34,8 ± 25,0 см Н₂O.

Бактериальный профиль образцов мочи, направленных на метагеномное секвенирование, представлен в таблице 3.

Результаты посевов мочи коррелировали с данными 16S рРНК секвенирования, однако секвенирование позволило выявить и идентифицировать большее количество микроорганизмов.

Среди бактерий, которые никогда не появлялись в посевах мочи, но были обнаружены у ряда больных по данным секвенирования метагенома представители семейств: Cellulomonadaceae (Cellulomonas spp.), Prevotellaceae (Prevotella melaninogenica, Prevotella spp.), Flavobacteriaceae, Bacillales Family X. Incertae Sedis, Gemella (Gemella asaccharolytica), carnobacteriaceae (carnobacterium spp.), Veillonellaceae (Veillonella spp.), peptoniphilaceae (parvimonas spp.), Sphingomonadaceae (Sphingomonas spp.), pseudoalteromonadaceae (pseudoalteromonas spp.), Moraxellaceae (Acinetobacter spp.), Vibrionaceae (Vibrio spp.).

Образцы HS1160 и YG6199, забранные у пациентов после ботулинотерапии, не дали бактериального роста на питательных средах, но при этом секвенирование позволило идентифицировать в них представителей нормальной микрофлоры. Аналогичную картину имел образец MM3401, но при посеве были выявлены Lactobacillus10*3. В данных трёх образцах низким было и содержание лейкоцитов, не более 1 - 2 в поле зрения.

Во всех образцах концентрация ДНК и количество лейкоцитов через шесть недель после ботулинотерапии были меньше, чем до лечения.

В ходе метагеномного секвенирования проанализировано 144562 16S рДНК прочтений. В каждом образце идентифицировано от 2 до 21 рода микроорганизмов. Наиболее часто встречающимися микроорганизмами были Escherichia, Klebsiella, Lactobacillus and Enterococcus (рис. 4). В целом, в моче больных НДНМП преобладали Enterobacterales.

Рисунок 4. Суммарное число прочтений различных видов бактерий, идентифицированных в образцах мочи
Figure 4. Sequences counts of bacterial species summarizing all urine samples

Наглядно состав микробиома мочи представлен на рисунке 5. Как видно на тепловой карте микробиом мочи женщин после ботулинотерапии чаще был представлен лактобактерииями, чем до процедуры. У трех пациенток (случаи №3, №5 и №6) произошла смена микрофлоры с преобладанием Enterobacteriaceae на Lactobacillales. У мужчин подобных изменений отмечено не было. В случае №1 пациент после инъекций ботулотоксина по-прежнему имел в моче в большом количестве представителей рода Klebsiella. У женщины в случае №2 Veillonella заместилась E. coli. У мужчины в случае №4 бактерии рода Enterococcus сменились представителей Escherichia.

Рисунок 5. Различия в относительном распределении долей различных родов бактерий в микробиоме мочи и женщин с НДНМП до и после внутридетрузорных инъекций ботулотоксина
Figure 5. Differences in relative sequences count between males and females before and after botulinum toxin injections

В исследовании не было выявлено корреляции между уродинамическими изменениями и трансформациями микробиома. Так, пациенты №1, №2 и №4 имели функциональные улучшения по данным уродинамического исследования, но позитивных изменений микробиома зарегистрировано не было.

Клинические наблюдение за пациентами в течение последующих 6 месяцев показало, что частота ИМП снизилась во всех случаях (табл. 4).

У мужчин в течение полугода не возникло эпизодов ИМП. У двух пациенток с позитивными изменениями микробиома также не было ИМп в течение указанного периода, третья пациентка с нормофлорой перенесла один эпизод ИМП. пациентка (случай №2), у которой в моче после инъекций ботулотоксина сохранилось преобладание энтеробактерий, дважды имела ИМП в течение 6 месяцев после процедуры, что является худшим результатом в группе.

Обсуждение

Ранее было показано, что эндоскопические инъекции бо^лотоксина уменьшают частоту рецидивов ИМП, однако не было известно, сопровождается ли это изменениями микробиома мочевого пузыря [27].

Впервые проведено исследование, сравнивающее микробиом мочи больных нейрогенным мочевым пузырём до и после инъекций ботулинического токсина в стенку мочевого пузыря. Для достижения максимально достоверных результатов использован метод секвенирования 16S рРНК.

D.E. Fouts et al. в 2012 году с помощью метагеномного секвенирвоания сравнили микробиом мочи здоровых добровольцев и больных нейрогенной дисфункцией нижних мочевыводящих путей, использующих различные методы отведения мочи [5]. преобладающими микроорганизмами в моче пациентов с НДНМП оказались представители Enterobacterales. Как показали авторы, доля энтеробактерий в микробиоме мочи женщин и мужчин с нейрогенной дисфункцией нижних мочевыводящих путей растёт с увеличением длительности НДНМП. Количество лактобактерий при этом пропорционально снижается. В первые месяцы после развития функциональных нарушений мочеиспускания микробиом пациентов имеет нормальный состав, но уже к концу первого года заболевания микрофлора оказывается обеднена лактобактериями и обильно населена энтеробактериями [5]. В нашем исследовании все пациенты исходно имели длительность НДНМП 15,3 ± 8,7 лет. Ожидаемо, что в микробиоме мочи методом метагеномного секвенирования были идентифицированы, преимущественно, Enterobacterales.

S.L. Groah et al. в 2016 году подтвердили данные D.E. Fouts et al. о том, что в моче больных НДНМп чаще встречаются Enterococcus faecalis, Proteus mirabilis and Klebsiella pneumonia [9]. Это также соотносится с полученными нами данными.

S. Bank et al. проанализировали образцы мочи 142 пациентов с различными урогенитальными заболеваниями (мочекаменной болезнью, ИМП, мочевыми дренажами)с помощью стандартного микробиологического исследования и ПЦР [28]. Авторы обнаружили, что наибольшая бактериальная колонизация характерная для пациентов старшего возраста и тех, кто имеет постоянные дренажи. Чаще всего в посевах мочи катетеризированных больных обнаруживались энтеробактерии.

Наличие лактобактерий в уретре и мочевом пузыре, вероятно, играет протективную роль в отношении инфекций мочевыводящих путей. Бактерии, продуцирующие молочную кислоту способны контролировать рост более вирулентных микроорганизмов, которые не способны существовать в более кислой среде [29]. D.E. Fouts et al. продемонстрировали уменьшение количества лактобактерий в моче женщин с НДНМп, которые мочатся самостоятельно, периодически катетеризируются или имеют постоянный катетер [5]. Это может быть одним из важнейших факторов риска ИМП в популяции больных нейрогенным мочевым пузырем. потенциальная возможность изменить микробиом обратно в сторону лактобактериальной флоры, воздействуя на мочевой пузырь с помощью ботулотоксина, кажется многообещающей. Кроме того, это вносит важный вклад в понимание патогенетических механизмов развития и рецидивирования ИМП у больных НДНМП.

Мы продемонстрировали, что несмотря на длительность заболевания и использование метода периодической катетеризации на фоне детрузоростабилизирующей терапии моча у трёх пациенток с НДНМП приобрела микробиом, близкий по составу к нормальному. Взаимосвязь функционального состояния мочевого пузыря и состава микробиома требует дальнейшего изучения.

Патогенетическая связь НДНМП с микрофлорой мочи, вероятно имеет несколько механизмов, с одной стороны, это ишемия стенки мочевого пузыря, связанная как с гиперрефлексией детрузора, так и с его перерастяжением в случае задержки мочи. Как ещё в 1972 году описывали J. Lapides et al. [30] кровоснабжение стенки мочевого пузыря может быть нарушено за счёт высокого внутрипузырного давления и/или перерастяжения органа. Ишемия тканей делает возможной колонизацию уротелия грамм-отрицательными представителями кишечной микрофлоры. Избегать повышения давления и перерастяжения - основа профилактики ИМП [31].

Другая проблема, вызванная нарушением питания стенки мочевого пузыря, замещение мышечных волокон соединительной тканью, что приводит к формировании трабекул и уменьшению пластичности мочевого пузыря, что, в свою очередь, усиливает ишемию [32].

Кроме того, высокое внутрипузырное давление обусловливает формирование пузырномочеточникового рефлюкса, что также является доказанным фактором риска ИМП у больных нейрогенным мочевым пузырём [21][32].

В нашем исследовании микробиома путём метагеномного секвенирования было невозможно оценить морфологические изменения в стенке мочевого пузыря, однако снижение внутрипузырного давления за счёт ботулотоксина, должно было улучшить кровоснабжение стенки мочевого пузыря, уменьшить явления ишемии, а также ретроградный ток мочи, обусловленный пузырно-мочеточниковым рефлюксом.

Проведённое исследование методом метагеномного секвенирования имеет ограничения, связанные с небольшим числом образцов, что обусловлено высокой стоимостью методики. Также важно учитывать, что с целью антибактериальной профилактики пациенты получали однократно 3 г фосфомицина трометамола per os, что могла оказать влияние на состав микробиома. Однако в анамнезе всех пациентов отмечалось многократное употребление различных антибактериальных препаратов. после введения ботулотоксина больные не получали антибактериальных препаратов до следующего забора мочи, однако могли использовать растительные препараты, что также могло повлиять на характер микрофлоры мочевыводящих путей.

Также необходимо учитывать, что состав микробиоты, вероятно, может подвергаться естественным временным колебаниям. Этот вопрос мало изучен. Как показали Ю.Л. Набока и соавт. [33], существуют незначительные различия в спектре микроорганизмов в моче и уровнях бактериурии у отдельных индивидуумов в течение дневного времени, однако, в целом, характерный спектр мочи идентифицируется независимо от дневного времени взятия материала для исследования.

Заключение

Пилотное исследование продемонстрировало значимость и перспективность изучения микробиома мочевыводящих путей больных НДНМП в динамике. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы подтвердить положительные изменения видового состава микробиоты мочи на фоне детрузоростабилизирующей терапии и снижение рисков рецидива ИМП.