Мониторинг микробиоты мочи и антибиотикорезистентности уропатогенов в одном урологическом стационаре

Введение

Проблема терапии и ведения пациентов с рецидивирующей неосложненной инфекцией нижних мочевых путей (РНИНМП), а в подавляющем большинстве это женщины [1][2], далека от разрешения. В соответствии с рекомендациями EAU (2020) [3] «диагноз неосложненного цистита можно с высокой вероятностью поставить на основании сфокусированного анализа симптомов нижних мочевых путей и отсутствии выделений из влагалища» (УД 2b). с одной стороны, абсолютно понятная и простая рекомендация, с другой стороны, предположить диагноз в большинстве случаев, не вызывает затруднений, но возникает вопрос: «Чем и как лечить когорту пациенток с РНИНМП, которые в анамнезе неоднократно получали курсы антибактериальной терапии (АБТ), а также занимались самолечением?» Формальный ответ очевиден - это использование препаратов, рекомендованных EAU (2020) [3]. Однако отсутствие консенсуса по ведению данной группы пациентов превращает данную проблему из очевидно простой в трудно разрешимую.

Цель исследования: изучение микробных паттернов мочи и антибиотикорезистентности уропатогенов в одном урологическом стационаре с 2010 по 2017 год.

Материалы и методы

Ретроспективно проанализированы результаты бактериологического исследования и данные индивидуальных антибиотикограмм пациенток с РНИНМП (n = 502). В 2010 - 2011 гг. обследованы 115 пациенток, в 2012 - 2013 гг. - 107, в 2014 - 2015 гг. — 111, в 2016 - 2017 гг. — 169.

Среди пациенток 351 (70,0%) были репродуктивного возраста. У 426 пациенток (84,9%) кратность рецидивов заболевания в год была четыре и более раз. У всех пациенток клинические симптомы заболевания были типичными и в общем анализе мочи выявлена лейкоцитурия (рис. 1).

Рисунок 1. Характеристика пациенток
Figure 1. Patients' demographics

Все 502 пациентки неоднократно (минимум 2 - 3 раза в год) получали курсы АБТ, 468 (93,2%) — занимались самолечением, причём из них 402 (80,1%) принимали фосфомицин при субъективном ощущении клиники заболевания.

Критерии включения в исследование: согласие пациенток на участие в исследовании, наличие в анамнезе клинических проявлений РНИНМп, двух обострений в течение полугода или трех обострений в течение года, лейкоциту- рия в общем анализе мочи, отсутствие в анамнезе и на момент исследования заболеваний, передающихся половым путем, а также вагинальных выделений.

Для бактериологического исследования у пациенток забирали среднюю порцию утренней мочи после соответствующей гигиенической процедуры в одноразовый (стерильный) контейнер Sterile Uricol («HiMedia», Индия) до назначения АБТ. порцию мочи разделяли на 2 аликвоты: для бактериологического исследования и общего анализа мочи.

Бактериологическое исследование (в зависимости от временного интервала) проводили по методике В.В. Меньшикова (2009) [4] и в соответствии с Клиническими рекомендациями (2014) [5]. помимо стандартного набора питательных сред были использованы хромогенные среды («HiMedia», Индия) для аэробных и анаэробных таксонов микроорганизмов: HiCrome Klebsiella Selective Agar Base, HiCrome Candida Differential Agar, HiCrome Enterococci Agar, HiCrome Aureus Agar Base, Blood Agar Base, Streptococcus Selection Agar, Rogosa SL Agar, Bifidobacterium Agar, Anaerobic Agar, Shaedler Agar, Bacteroides Bile Esculinum Agar, Shaedler Broth. Посевы инкубировали в аэробных (t+37⁰С, 24 часа) и анаэробных (AnaeroHiGas Pak) условиях культивирования (t+37⁰С, 48 – 72 часа) [6]. Микроорганизмы, выделенные из мочи, идентифицировали по общепринятым методикам.

Антибиотикочувствительность/резистент- ность выделенных из мочи микроорганизмов проводили в соответствии с методическими указаниями [7] и клиническими рекомендациями [8] на среде Mueller Hinton agar («HiMedia», Индия) диско-диффузионным методом с дисками той же фирмы. При верификации в моче представителей семейства Enterobacteriacae определяли продукцию β-лактамаз расширенного спектра (БЛРС) [7].

Cтатистический анализ проводили в среде статистической обработки и визуализации данных «R ver 3.2» («R Foundation for Statistical Computing», Вена, Австрия). Средние значения выделенных микроорганизмов представлены в виде Медиана с интерквартильным размахом [Нижний квартиль; Верхний квартиль]. Было проведено сравнение медиан концентраций с использованием теста Краскала-Уоллиса (или Манна-Уитни). Для попарных апостериорных сравнений применялся метод Неменьи. Значимость различий считалась на уровне р <0,05.

Результаты

На примере одного урологического стационара проанализированы частоты обнаружения общедоказанных уропатогенов (представителей семейства Enterobacteriaceae, Enterococcus spp., S. aureus, Candida spp.), выделенных из мочи пациенток с РНИНМП в течение 2010 - 2017 гг. (рис. 2).

Рисунок 2. Частоты обнаружения каузативных патогенов в моче (*p <0,05)
Figure 2. Detection frequency of causative pathogens in urine samples (*p <0,05)

Частоты обнаружения в моче E. coli колебались незначительно (р >0,05) от 43,0% (2012 - 2013 гг.) до 55,9% (2014 - 2015 гг.). Для остальных представителей семейства Enterobacteriaceae более низкий показатель наблюдали в 2010 - 2011 гг. (13,9%) с достоверным нарастанием (р <0,05) в 2012 - 2013 гг. (32,6%). С 2014 по 2017 год частоты обнаружения энтеробактерий в моче варьировались незначительно (21,6% и 26,6% соответственно).

Для Enterococcus spp. изучаемый показатель снижался в 2012 - 2013 гг. (29,0% против 40,0% в 2010 - 2011 гг., р <0,05) с повышением в 2014 - 2015 гг. практически до уровня 2010 - 2011 гг. (38,7%, р >0,05), но с достоверным нарастанием (52,7%, p <0,05) к 2016 - 2017 гг. по сравнению с другими временными интервалами. Частоты обнаружения в моче S. aureus колебались незначительно с 2010 по 2013 год, однако в 2014 - 2015 гг. изучаемый показатель (p >0,05) несколько нарастал, а в 2016 - 2017 гг. снижался (p <0,05) по сравнению с предыдущим временным интервалом. Присутствие в моче дрожжеподобных грибов рода Candida достоверно (p >0,05) не отличалось в исследуемые периоды, и их паттерн был представлен: C.tropicalis, C. albicans (по 3,2%), C. glabrata (1,0%), C. krusei (0,8%) (рис. 2).

Анализируя видовой спектр Enterococcus spp., необходимо отметить, что он варьировался незначительно (p >0,05) в исследуемый период (рис. 3). Однако недифференцированные виды энтерококков достоверно (p <0,05) реже регистрировали в 2012 - 2013 гг. по сравнению с 2014 - 2015 гг. В 2016 - 2017 гг. изучаемый показатель был равнозначен 2010 - 2011 гг. (30,3% и 30,4% соответственно).

Рисунок 3. Спектр энтерококков, выделенных из мочи (*p<0,05)
Figure 3. Enterococci spectrum isolated from urine (*p<0,05)

Неклостридиальные анаэробные бактерии (НАБ) не верифицируются в моче при стандартном бактериологическом исследовании. При использовании питательных сред для этих бактерий и анаэробных условий культивирования микроорганизмы данного кластера обнаруживались в моче у большинства пациенток с РНИНМП (рис. 4), а частота их обнаружения колебалась от 94,1% (2016 - 2017 гг.) до 99,1% (2010 - 2011 гг.).

Рисунок 4. Частоты обнаружения НАБ в моче
Figure 4. Detection frequency of NAB in urine

За исследуемый период таксономическая структура НАБ была представлена 10 - 13 родами (Lactobacillus spp., Eubacterium spp., peptococcus spp., Propionibacterium spp., Peptostreptococcus spp., Bifidobarterium spp., Barteroides spp., Veillonella spp., Fusobarterium spp., Megasphaera spp., Prevotella spp., Mobiluncus spp., Actinomyces spp.). Доминирующими родами в исследуемый период являлись Lactobacillus spp., Eubacterium spp. Обнаружение peptostreptococcus spp., Bifidobacterium spp., Fusobacterium spp., prevotella spp., Mobiluncus spp. в исследуемый период варьировалось незначительно (p >0,05). Однако для 7 таксонов были обнаружены достоверные различия (p <0,05) по исследуемому признаку (табл. 1).

В моче пациенток с РНИНПМ в динамике исследования снижались частоты обнаружения (p <0,05) Lactobacillus spp., Eubacterium spp., Peptococcus spp., Propionibacterium spp. Изучаемый показатель был достоверно (p <0,05) выше в 2010 - 2011 гг. Для Bacteroides spp, Veillonelia spp., Megasphaera spp. наблюдалась противоположная тенденция со значимым (p <0,05) нарастанием в 2016 - 2017 гг., хотя с 2010 по 2015 год частота обнаружения этих таксонов колебалась незначительно (p >0,05).

В исследуемый период времени частоты обнаружения в моче КОС достоверно не отличались (p >0,05), но в 2016 - 2017 гг. их регистрировали реже (р <0,05) по сравнению с 2014 - 2015 гг. За восьмилетний период исследования патсрн КОС был представлен S. epidermidis (38,9%), S. haemo- lyticus (18,3%), S. warneri (10,8%), S. lentus (10,4%), S. saprophyticus (4,2%), S. coagulans (2,0%), S. xy- losus (1,0%). Corynebacterium spp. значимо чаще (р <0,05) выделяли из мочи в 2010 - 2011 гг. (рис. 5), в период 2012 - 2017 гг. достоверных отличий в частотах обнаружения данных микроорганизмов не обнаружено (р >0,05).

Рисунок 5. Частоты обнаружения КОС и Corynebacterium spp. в моче (*p<0,05)
Figure 5. Coagulase-negative staphylococci and Corynebacterium spp. detection frequencies in urine (*p<0,05)

При анализе средних уровней бактериурии в исследуемый период значимых отличий для большинства таксонов микроорганизмов, выделенных из мочи пациенток с РНИНМП, не выявлено (p >0,05). Исключение составили Candida spp., средний уровень бактериурии которых в 2012 - 2015 гг. был достоверно выше по сравнению с другими временными интервалами. В 2012 - 2013 гг. изучаемый показатель для КОС был выше (р <0,05) по сравнению с 2010 - 2011 гг. и 2014 - 2017 гг. Обращают на себя внимание верхние квартили бактериурии, которые для большинства таксонов были > 10^3,0 КОЕ/мл (табл. 2).

Таким образом, за период 2010 - 2017 гг. микробиота мочи пациенток с РНИНМП характеризовалась определенным постоянством микробных паттернов с различными вариантами микробных композиций, но с преобладанием (94,1% - 99,1%) анаэробно-аэробных.

За анализируемый период (2010 - 2017 гг.) проведено изучение антибиотикорезистентности (АБР) различных таксонов микробиоты, выделенной из мочи пациенток с РНИНМП. АБР E. coli к основному препарату для лечения РНИНМП фосфомицину к 2017 году значимо (р <0,05) нарастала с 25,7% до 48,9%, а других представителей этого семейства, наоборот, снижалась (р <0,05) (рис. 6).

Рисунок 6. Динамика антибиотикорезистентности энтеробактерий к фосфомицину (*p<0,05)
Figure 6. Dynamics of enterobacteria fosfomycin antibiotic resistance (*p<0,05)

К 2017 году значимо (р <0,05) увеличивалась частота обнаружения штаммов E. coli, продуцирующих БЛРС (рис. 7). Для других представителей семейства Enterobacteriaceae изучаемый показатель был также стабильно высок со значительным увеличением в 2015 - 2015 гг. по сравнению с аналогичными показателями в 2010 - 2011 гг.

Рисунок 7. Частоты обнаружения энтеробактерий, продуцирующих БЛРС (*p<0,05)
Figure 7. Detection frequency of extended-spectrum b-lactamase producing enterobacteria (*p<0,05)

Антибиотикрезистентность Enterococcus spp. к фосфомицину колебалась от 27,8% в 2010 - 2011 гг. до 30,1% в 2016 - 2017 гг. со значимым (р <0,05) нарастанием показателя в 2012 - 2013 гг. по сравнению с аналогичными в 2010 - 2011 гг. (рис. 8).

Рисунок 8. Динамика антибиотикорезистентности Enterococcus spp. к фосфомицину (*p<0,05)
Figure 8. Dynamics of Enterococcus spp. fosfomycin antibiotic resistance (*p<0,05)

При анализе АБР обширного кластера КОС (рис. 9) выявлены следующие тенденции: изучаемый признак значимо (p <0,05) нарастал к 2017 году для фосфомицина, амикацина и фузидина и снижался (p <0,05) для амоксициллин/клавула- новой кислоты и некоторых карбапенемов.

Рисунок 9. Динамика антибиотикорезистентности КОС (*p<0,05)
Figure 9. Dynamics of coagulase-negative staphylococci antibiotic resistance (*p<0,05)

Для представителей НАБ (рис. 10) выявлено снижение АБР к фосфомицину (p <0,05), амокси- циллин/клавулановой кислоте (p>0,05), имипе- нему (p <0,05) и значимое (p <0,05) нарастание к меропенему и эртапенему.

Рисунок 10. Динамика антибиотикорезистентности НАБ (*p<0,05)
Figure 10. Dynamics of non-clostridial anaerobic bacteria antibiotic resistance (*p<0,05)

Обсуждение

По поводу этиологической структуры РНИНМП опубликовано достаточно большое количество работ с основным фокусом исследователей на представителях семейства Enterobacteriaceae [9][10]. Мы никоим образом не игнорируем их роль в манифестации заболевания. Но возникает вопрос, а если только энтеробактерии причастны к развитию заболевания, то почему в течение десятилетий не намечается даже намека на прогресс в лечении этой сложной когорты пациентов? Почему микромир снова и снова побеждает человека даже в таком «не сложном» вопросе как этиологическая структура РНИНМП? Может быть, дело не только в бактериях и в их фантастической пластичности и приспособлению к макроорганизму, к антибактериальным препаратам, к тонким взаимоотношениям с иммунной системой и т.д. Видимо, основная проблема заключается в тех позициях, на которых стоит исследователь, занимающийся изучением данной проблемы. Невозможно рассматривать этиологическую структуру РНИНМП, изолированно, в отрыве от микробиоты нашего организма в целом. Ведь сфокусировавшись только на строго определенной группе микроорганизмов (каузативные уропатогенны) за «кадром» остаются просто миры микроорганизмов, видовое разнообразие которых включает более 1000 видов с общим количеством генов более 3 миллионов [11][12][13][14].

Самую многочисленную (70,0%) нишу в макроорганизме по качественному признаку занимает кишечник [15]. Его эпителиальные барьеры допускают возможность транслокации условнопатогенных микроорганизмов (заметьте всех, а не только энтеробактерий) в другие биотопы с дальнейшим дебютом воспаления, причем работы некоторых исследователей [16][17] свидетельствуют о том, что острый цистит хорошо вписывается в эту схему и мочевой микробиом в условиях острого цистита находится в дисбиоти- ческом состоянии, тем самым вызывая воспаление мочевого пузыря и пиурию. Поэтому изучение этиологической структуры РНИНМП связано с тем, на каких позициях инфицирования органов мочевой системы мы стоим. На восходящем пути или эндогенном (с гематогенной и лимфогенной транслокацией условно-патогенных микроорганизмов), или мы понимаем, что мочевой пузырь имеет свою микробиоту и возникшие дисбио- тические изменения могут приводить к манифестации острого процесса? Полученные нами данные о микст-инфекции у пациенток с РНИНМП ложатся в канву двух последних предположений. В данном контексте уместно процитировать авторов монографии «Urinary tract infection» (2017) K.A. Kline и A.L. Lewis «...Мы предполагаем, что будущие исследования осветят ранее недооцененную роль полимикробной микробиоты в мочевых путях» [18].

В свете полученных данных для расшифровки патогенеза ряда хронических заболеваний макроорганизма активно изучается понятие «микробиота - кишечник - мозг» [19][20]. Данная ось многофункциональная и включает в себя иммунные, эндокринные и нейрогуморальные пути. Однако абсолютно не изучена ось «микробиота - кишечник - органы мочевой системы». И если для кишечника уже сделаны попытки описания функционального ядра микробиоты с концепцией филометаболического ядра [12][21][22][23][24][25], то для органов мочевой системы нет даже попыток в этом направлении.

Обсуждая вопросы АБР уропатогенов необходимо отметить, что данные во многих исследованиях разнонаправлены, что, по-видимому, связано с контингентом обследуемых и с множеством входящих факторов, в частности, длительности заболевания, количества рецидивов в год, количества курсов АБТ и т.д. Полученные нами результаты об АБР различных таксонов микробиоты, выделенных из мочи пациенток с РНИНМП мы ни в коем случае не экстраполируем на другие центры, так как исследуемая когорта пациенток была сложной, в первую очередь, с анамнестических позиций. Проведенная работа еще раз подчеркивает сложность ведения данной когорты женщин, некую тупиковую ситуацию в плане проведения эффективной АБТ и ставит ряд вопросов, касающихся наших стереотипов об этиологической структуре заболевания, его патогенезе и «эффективности» эмпирического антибактериального лечения данной патологии.

Выводы

1. У пациенток с РНИНМП (2010 - 2017 гг.) в большинстве случаев в моче регистрируют аэробно-анаэробные бактериальные ассоциации. Частота обнаружения coli колеблется около 50,0%.
2. с 2010 по 2017 год в моче значимо (р <0,05) снижаются частоты обнаружения Lactobacillus spp., Eubacterium spp., Peptococcus spp., Propionibacterium spp., и повышаются Bacteroides spp., Veillonella spp., Megasphaera spp. Данные изменения микробных патернов мочи могут быть следствием антибактериальной терапии, а также дисбиотических изменений в близлежащих биотопах, в частности кишечнике.
3. Средние уровни бактериурии для представителей грампозитивной флоры и неклостри- диальных анаэробов колебались от 10² до 10 ^2,8 КОЕ/мл. Однако верхний размах (верхний квартиль) уровней бактериурии для основных таксонов микробиоты был ≥10³ КОЕ/мл.
4. На протяжении 8 лет значимо (р <0,05) нарастает антибиотикорезистентность coli к фос- фомицину (48,9%) по сравнению с аналогичными показателям в 2010 году (25,7%) и снижается к 2017 году (43,5%) для других представителей семейства Enterobacteriaceae также по сравнению с 2010 годом (78,6%).
5. В течение 8 лет значимо (р <0,05) увеличивается (81,1%) частота обнаружения штаммов coli, продуцирующих бета-лактамазы расширенного спектра по сравнению с показателями 2010 года (65,7%).