КОРРЕКЦИЯ НАРУШЕНИЙ ФУНКЦИИ ЭНДОТЕЛИЯ В ПОЧКЕ ДИСТАНТНЫМ ИШЕМИЧЕСКИМ И ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИМ ПРЕКОНДИЦИОНИРОВАНИЕМ ПРИ ТЕПЛОВОЙ ИШЕМИИ

Введение

В современной хирургии, с развитием оперативных вмешательств, требующих временного прекращения кровотока по определенным сосудам на одной из лидирующих позиций стоит проблема ишемических и реперфузионных повреждений органов и тканей. Особое место в этом отношении занимает тепловая ише­мия почки, при которой расширение временного интервала обескровливания органа имеет прин­ципиальное значение. Одним из способов повы­шения резистентности органов к дефициту кис­лорода является физиологическое воздействие на систему регуляции клеточного метаболизма путем периодического создания условий умерен­ного дефицита кислорода. В эксперименте давно доказан «тренирующий» эффект периодической гипоксии, адаптирующей организм животного к условиям недостатка кислорода. В механизме этой адаптации важную роль играют как реакции на уровне организма (гипервентиляция, активиза­ция деятельности сердца, усиление эритропоэза и др.), так и модификация клеточного метаболизма (активизация гликолиза, повышение способности утилизировать кислород при его низком содер­жании, увеличение мощности антиоксидантной системы клеточной защиты и др.). В результате, гипоксическая тренировка приводит к лучшей переносимости клетками дефицита кислорода в ходе ишемии и в начальных периодах реперфузии [1]. В 1964 году Janoff назвал этот феномен прекондиционированием или толерантностью.

Ишемическим прекондиционированием на­зывают воздействие кратковременной ишемии (2-15 мин) и реперфузии (5-10 мин) на орган- мишень (головной мозг, сердце) перед модели­рованием длительной ишемии [2]. Детальное изучение механизмов действия ишемического прекондиционирования на аффекторную клетку выявило основной путь реализации этого фено­мена. Это активация митохондриальных и рети­кулярных АТФ зависимых K⁺ каналов посредством активации рецепторов аденозина 1 типа [3]. Другая интересная гипотеза возникла на основе концепции стимуляции эндогенного защитно­го механизма. Прекондиционирование вызы­вает экспрессию эндогенных антиоксидантных ферментов (GSHPx-1) и белков теплового шока HSP27, HSP32 и HSP70. Кроме этого прекондиционирование формирует каскад преобразования сигналов, подавляя сигналы гибели и активируя сигналы выживания [1, 4]. Следовательно, весь­ма вероятно, что некоторые проапоптозные и антиапоптозные гены и факторы матричного анали­за (в том числе JNK-1, c-Jun, NF-κB и АР-1) играют весьма важную роль в процессе прекондиционирования (подобно роли окиси азота).

Огромную роль во вторичных повреждениях ткани при воздействии ишемии играют так назы­ваемые реперфузионные повреждения [5]. Было установлено, что возобновление кровотока в си­стеме сосудов органа после перенесенного эпи­зода ишемии приводит к еще большему усиле­нию клеточного повреждения за счёт активации оксидантного и нитрозативного стресса [6, 7].

Было показано положительное влияние прекондиционирования на развитие реперфузионных осложнений [8, 9]. Однако в реальной жизни не­возможно заранее знать время начала процесса. Поэтому исследования последних лет акцентируют свое внимание на феномене ишемического пост­кондиционирования.

Основная масса работ посвящена исследова­нию феномена прекондиционирования в кардио­логии, неврологии, хирургии, в том числе и в уроло­гии, однако полученные результаты проведенных работ ещё далеки от желаемых. При этом остаётся неисследованной возможность коррекции ише­мических нарушений при операциях на почке в условиях тепловой ишемии Одним из ключевых звеньев в патогенезе острого реперфузионного по­вреждения является дисфункция эндотелия в этот период, что проявляется нарушением микроцирку­ляции в органе. В связи с этим целью настоящей работы явилось изучение микроциркуляции почки и возможности коррекции ее нарушений препаратами из группы ингибиторов фосфодиэстеразы 5 типа в ранний и поздний реперфузионные периоды.

Материалы и методы

Опыты были выполнены на 100 крысах сам­цах линии «Wistar» массой 250-300 гр. Распреде­ление животных осуществлялось рандомизаци­ей по массе, каждая рандомизированная группа состояла не менее, чем из 10 крыс. Для проведе­ния эксперимента отобраны крысы, прошедшие 14-дневный карантинный режим в условиях ви­вария, без внешних признаков наличия болезни. Условиями содержания животных в течение про­ведения исследований были: стандартная экс­периментальная биологически чистая комната, по 12 часов нахождения в темном и светлом ре­жиме освещения за сутки, температура воздуха 22-24 °С. Крысы получали гранулированный корм и фильтрованную водопроводную воду. Экспери­менты проводились во второй половине дня в соответствии с положениями из «Конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей» (Страсбург, 18.03.1986 г.). Для наркоза использо­вали хлоралгидрат (300 мг/кг внутрибрюшинно).

Дистантное ишемическое прекондициони- рование осуществляли при помощи наложения эластичного жгута на верхнюю треть контрла­терального бедра на 10 минут с последующей реперфузией в течение 30 минут перед непо­средственным моделированием ишемии почки. Отсутствие пульсации артерий нижней конечно­сти, появление бледности и синюшности кожи яв­лялось контролем эффективности манипуляции.

Ингибиторы фосфодиэстеразы-5 силденафил и тадалафил вводили внутрибрюшинно в дозе 4 мг/кг и 1 мг/кг массы животного соответствен­но с учетом межвидового пересчета доз на 10% диметилсульфоксиде за 30 минут до моделиро­вания ишемии-реперфузии почек.

Блокатор АТФ зависимых К⁺ каналов глибенкламид (Sigma) вводили внутрибрюшинно в дозе 5 мг/кг веса на 10% диметилсульфоксиде за 30 минут до проведения дистантного ише­мического прекондиционирования и/или вве­дения изученных препаратов. Моделирование ADMA-подобного состояния производили пред­варительным введением ADMA-подобного агента - неселективного блокатора NO-синтазы N-нитро- L-аргинин-метилового эфира (L-NAME) в дозе 25 мг/кг/сут. Далее моделировали ишемическое и реперфузионное повреждение почек. Животное фиксировали, лёжа на спине, удаляли шерсть и об­рабатывали кожу антисептиками. Доступ к почкам осуществлялся лапаротомически, производили вскрытие брюшной полости, петли кишечника и брыжейка смещались в левую сторону, затем мобилизировалась почка и сосудистая ножка, накла­дывался атравматичный сосудистый зажим на 30 минут. Аналогичную манипуляцию проводили на левой почке. Критерием достаточного пережатия почечной ножки служило изменение цвета органа с красного на темно-красный. Вслед за этим, почки покрывали смоченной антисептиками салфеткой и погружали в рану. Через 30 минут производили выведение органов в рану, снятие зажимов и за­пуск реперфузионного периода длительностью 40 минут. Визуально определяли макроскопическое состояние поверхности почки.

Оценку уровня микроциркуляции произво­дили при помощи аппарата для электрофизио- логических исследований МР150, производства «БИОПАК Системс, Инк» (США) в комплекте с модулями лазерной допплеровской флоуметрии (ЛДФ) и инвазивного игольчатого датчика TSD144. Игольчатые датчики устанавливали в пяти точках на поверхности почки. Уровень микроциркуля­ции выражался в перфузионных единицах (ПЕд). Запись и обработку результатов ЛДФ выполняли с помощью программы AcqKnowledge, версия 3.8.1. В соответствии с протоколом исследова­ния измерения уровня микроциркуляции произ­водили через 40 минут от начала реперфузионного периода и спустя двое суток после снятия зажима. Для оценки функционального состояния почки через сутки после реперфузии, согласно дизайну эксперимента, животных помещали в метаболические клетки на 24 часа с целью сбора суточной мочи. Затем, измеряли суточный диу­рез и определяли концентрацию креатинина в моче и плазме крови. За скорость клубочковой фильтрации принят клиренс креатинина, рассчи­танный по формуле.

Экспрессию эндотелиальной NO-синтазы (eNOS) определяли иммуногистохимическим методом. Описательное исследование гистоло­гических и иммуногистохимических препаратов выполняли под микроскопом Axio Scope Al (Carl Zeiss Microimaging GMbH, Германия).

Для всех данных была применена описа­тельная статистика: данные проверены на нор­мальность распределения. Тип распределения определялся критерием Шапиро-Уилка. В случае нормального распределения были подсчитаны среднее значение (M) и стандартная ошибка сред­него (m). Межгрупповые различия анализирова­лись параметрическими (t-критерий Стьюдента) или непараметрическими (критерий Манна-Уит­ни) методами, в зависимости от типа распреде­ления. Все расчеты выполнены с помощью пакета статистических программ Microsoft Excel 7.0.

Результаты и обсуждение

Оценка уровня микроциркуляции в почках и экспрессия eNOS. После моделирования пато­логии через 40 минут и 48 часов осуществляли измерение микроциркуляции методом ЛДФ. Ре­зультаты представлены в таблице 1. Показатели микроциркуляции в почках у интактных животных составили 814,66±63,22 ПЕд. В группе животных с 30-минутной ишемией почек через 40 минут по­сле снятия зажима с сосудистой ножки отмечалось выраженное увеличение микроциркуляции до 2069,51±71,99 ПЕд, что достоверно выше показа­телей в группе интактных животных. Данное по­вышение показателя свидетельствует о развитии реактивной гиперемии. Применение дистантного ишемического прекондиционирования (ДИП) и ин­гибиторов фосфодиэстеразы 5 типа (иФДЭ-5) сил­денафила и тадалафила приводило к уменьшению уровня микроциркуляции через 40 минут после снятия зажима по сравнению с контрольной груп­пой и составило 1306,01±101,17 ПЕд, 1235,17±77,66 ПЕд и 1330,73±93,72 ПЕд соответственно.

Введение блокатора АТФ зависимых К⁺ кана­лов - глибенкламида до моделирования ишемии практически не влияло на уровень микроцирку­ляции через 40 минут после снятия зажима, кото­рый составил 2114,76±73,20 ПЕд. С другой сторо­ны, после 30 минутного моделирования ишемии при применении дистантного ишемического прекондиционирования и фармакологического пре­кондиционирования иФДЭ-5 в сочетании с глибенкламидом уровень микроциркуляции для ДИП составил 1712,31±117,02 ПЕд, для силде­нафила 1813,04±132,57 ПЕд, для тадалафила - 1946,92±93,92 ПЕд. Таким образом подтвержда­ется гипотеза о вовлечении АТФ зависимых К⁺ каналов в реализацию ренопротектинвых эффек­тов дистантного ишемического прекондиционирования и фармакологического прекондиционирования иФДЭ-5, силденафилом и тадалафилом.

Сочетание моделирования ишемии с L-NAME-индуцированным дефицитом оксида азота не показало существенной разницы в по­казателях микроциркуляции через 40 минут по сравнению с группой животных, которым L-NAME предварительно не вводился. Моде­лирование 30-минутной ишемии, применение ДИП и иФДЭ-5 в сочетании с введением L-NAME привело к статистически достоверному сниже­нию микроциркуляции в сравнении с группой животных с предварительным введением инги­битора NO-синтазы, но без применения ДИП и фармакологического прекондиционирования.

Так, в группе с применением ДИП показатели микроциркуляции через 40 минут после возоб­новления кровотока составили 1152,68 ± 56,90 ПЕд, с применением силденафила - 1248,07 ± 59,28 ПЕд, тадалафила - 1378,18 ± 79,88 ПЕд. На вторые сутки после возобновления кровотока в группе с 30-минутной ишемией уровень микро­циркуляции резко снизился до 316,77±25,29 ПЕд. Коррекция дистантным ишемическим и фарма­кологическим прекондиционированием силде­нафилом и тадалафилом приводила к нормали­зации показателей микроциркуляции в почечной ткани до 588,37±44,15 ПЕд, 701,59±55,35 ПЕд и 632,55±67,81 ПЕд соответственно. При этом, по­лученные результаты достоверно отличались от показателей микроциркуляции в группе интактных животных и группе с моделированием ишемии. Следует отметить, что предваритель­ное введение глибенкламида до моделирования ишемии не приводило к статистически значимо­му снижению уровня микроциркуляции в ткани почек, который составил 273,70±18,30 ПЕд. Вве­дение глибенкламида нивелировало выражен­ные ренопротективные эффекты дистантного ишемического и фармакологического преконди - ционирования. Уровень микроциркуляции был достоверно лучше группы с моделированием 30-минутной ишемии лишь в группе тадалафила (406,21±35,18).

Сочетание моделирования ишемии с L-NAME- индуцированным дефицитом оксида азота не показало существенной разницы в показателях микроциркуляции через 48 часов реперфузии по сравнению с группой животных, которым L- NAME предварительно не вводился. На вторые сутки исследования показатели микроциркуля­ции при применении ДИП, силденафила и тада­лафила и предварительного введения L-NAME оказались достоверно ниже относительно тако­вых без введения блокатора NO-синтазы и со­ставили 350,69±29,18 ПЕд, 372,00±33,73 ПЕд, 302,20±23,62 ПЕд соответственно.

Экспрессия eNOS, определяемая удельной пло­щадью иммунореактивного вещества в эндотелии сосудов коркового вещества почки у интактных животных составила 18,75±1,70% (табл. 1). Через двое суток после моделирования ишемии экс­прессия eNOS в клубочках значительно снижена - 4,55±1,10%. На фоне применения ДИП отмечался некоторый позитивный эффект, среднее значение экспрессии eNOS составляло 9,10±1,05%, что в 2 раза выше значения при моделировании ишемии. Введение ингибиторов фосфодиэстеразы-5 спо­собствовало выраженному росту экспрессии eNOS по сравнению с контрольной группой и составило 16,48±1,49% и 14,10±1,13% для силденафила и тадалафила соответственно. При фармакологическом контроле блокатором АТФ-зависимых калиевых ка­налов глибенкламидом на фоне дистантного ише­мического прекондиционирования отмечалось снижение экспрессии eNOS, как и в случае фар­макологического прекондиционирования силде­нафилом и тадалафилом, до уровня 6,20±0,90%, 13,46±1,40% и 11,38±1,15% соответственно. На фоне введения L-NAME отмечалось ещё более вы­раженное уменьшение экспрессии eNOS, при ДИП экспрессия составила 4,46±0,77%, при введении силденафила 9,96±1,08%, тадалафила 7,65±1,04%.

Оценка функционального состояния почек. Результаты, полученные в ходе оценки функцио­нального состояния почек представлены в табли­це 2. В контрольной группе животных с ишемиче­скими и реперфузионными повреждениями почек концентрация креатинина повышалась в 1,9 раз по сравнению с данными интактной группы, что соответствует критериям острого почечного повреж­дения. Применение дистантного ишемического прекондиционирования снижало концентрацию креатинина до 109,3±7,16 мкмоль/л. Применение силденафила и тадалафила также способствовало снижению концентрации креатинина до 98,6±6,08 и 87,5±4,97мкмоль/л соответственно. Однако, лишь применение тадалафила позволяло норма­лизовать данный показатель до значений, не от­личавшихся статистически от уровня креатинина интактных животных.

Применение глибенкламида, блокатора АТФ- зависимых калиевых каналов, не усугубляло тече­ние ишемии-реперфузии, однако нивелировало положительные ренопротективные эффекты ДИП, силденафила и тадалафила. Значение уровня креатинина находилось на уровне 133,7±5,4 мкмоль/л, 131,7±4,67 мкмоль/л, 129,6±6,25 мкмоль/л соот­ветственно и не отличалось от группы животных с изолированным моделированием 30-минутной ишемии, за исключением группы тадалафила. До­полнительное моделирование дефицита оксида азота с помощью L-NAME приводило к значитель­ному усугублению острого почечного повреждения по показателю креатинина, концентрация в плазме крови которого составила 166,8±7,79, что соответ­ствует более тяжелой степени почечной недоста­точности. Коррекция дистантным ишемическим и фармакологическим прекондиционированием с использованием силденафила и тадалафила при­вела к незначительному снижению уровня креатинина до 130±4,19 мкмоль/л, 115,5±6,26 мкмоль/л, 122,2±6,29 мкмоль/л соответственно. Данные, приведенные в таблице 2, указывают, что ише­мия и реперфузия почек сопровождаются резко выраженным снижением скорости клубочковой фильтрации; так у крыс с моделированием билате­ральной ишемии СКФ на вторые сутки наблюдения снижалась в 1,8 раз по сравнению с интактными животными. На фоне применения дистантного ишемического и фармакологического прекондиционирования силденафилом отмечалось незна­чительное улучшение функции почек, о чем сви­детельствует повышение среднего значения СКФ до 0,81±0,08 мл/мин и 0,96±0,09 мл/мин соответ­ственно. Фармакологическая коррекция ишеми­ческих и реперфузионных повреждений тадалафилом достоверно повышало показатели СКФ до 1,16±0,04 мл/мин, что свидетельствует о наиболее высоком ренопротективном потенциале. Блокада ключевой мишени для потенциальных фармаколо­гических агентов глибенкламидом, не приводила к усугублению функциональных маркеров почечной недостаточности, однако не позволяла реализо­вывать ренопротективные эффекты ДИП, силде­нафила и тадалафила. В подтверждение гипотезы об усугублении течения почечного повреждения наличием коморбидной ADMA-ассоциированной патологии, средний показатель СКФ на фоне пред­варительного введения L-NAME составил 0,43±0,05 мл/мин. Применение дистантного ишемического и фармакологического прекондиционирования ингибиторами фосфодиэстеразы силденафилом и тадалафилом на фоне блокады NO-синтазы позволило восстановить показатель СКФ до значений жи­вотных из группы с моделированием 30-минутной ишемии.

Заключение

Применение дистантного ишемического и фармакологического прекондиционирования ин­гибиторами фосфодиэстеразы 5 типа силденафи­лом и тадалафилом дает протективный эффект, выражающийся в улучшении показателей микро­циркуляции и функционального состояния почки при её «тепловой ишемии». В реализации поло­жительных эффектов дистантного ишемического и фармакологического прекондиционирования при «тепловой ишемии» почки значительную роль играет активация АТФ-зависимых К⁺ каналов. В условиях ADMA-подобного состояния (дефицит ок­сида азота в результате ингибирования eNOS вве­дением L-NAME) расстройства микроциркуляции и функционального состояния почки при «тепло­вой ишемии» более выражены, а положительные эффекты дистантного ишемического и фармако­логического прекондиционирования снижаются.